Summary

Eine Intragewebe-Radiometrie-Mikrosonde zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe

Published: June 02, 2023
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Summary

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Messung der Strahldichte in situ in lebendem Gewebe beschrieben. Diese Arbeit enthält Details zum Aufbau von mikroskaligen Sonden für verschiedene Messungen von Strahldichte und Bestrahlungsstärke, bietet Anleitungen für die Montage von Gewebe zur Charakterisierung der Strahldichte und skizziert Berechnungsmethoden zur Analyse der resultierenden Daten.

Abstract

Organismen erscheinen vor allem deshalb undurchsichtig, weil ihre äußeren Gewebeschichten stark an einfallendem Licht gestreut werden; Stark absorbierende Pigmente, wie z. B. Blut, haben typischerweise eine enge Absorption, so dass der mittlere freie Weg des Lichts außerhalb der Absorptionsspitzen recht lang sein kann. Da Menschen nicht durch Gewebe hindurchsehen können, stellen sie sich im Allgemeinen vor, dass Gewebe wie Gehirn, Fett und Knochen wenig oder gar kein Licht enthalten. Photoresponsive Opsin-Proteine werden jedoch in vielen dieser Gewebe exprimiert, und ihre Funktionen sind nur unzureichend verstanden. Auch die Strahlkraft im Gewebe ist wichtig für das Verständnis der Photosynthese. Zum Beispiel sind Riesenmuscheln stark absorbierend, halten aber eine dichte Algenpopulation tief im Gewebe aufrecht. Die Lichtausbreitung durch Systeme wie Sedimente und Biofilme kann komplex sein, und diese Gemeinschaften können einen wichtigen Beitrag zur Produktivität von Ökosystemen leisten. Daher wurde eine Methode zur Konstruktion optischer Mikrosonden zur Messung der skalaren Bestrahlungsstärke (Photonenfluss, der einen Punkt schneidet) und der Abwärtsbestrahlungsstärke (Photonenfluss, der eine Ebene senkrecht durchquert) entwickelt, um diese Phänomene im lebenden Gewebe besser zu verstehen. Diese Technik ist auch in Feldlaboren umsetzbar. Diese Mikrosonden bestehen aus wärmegezogenen Lichtwellenleitern, die dann in gezogenen Glaspipetten befestigt werden. Um die Winkelakzeptanz der Sonde zu verändern, wird dann eine 10-100 μm große Kugel aus UV-härtendem Epoxidharz, gemischt mit Titandioxid, am Ende einer gezogenen, getrimmten Faser befestigt. Die Sonde wird in lebendes Gewebe eingeführt und ihre Position wird mit einem Mikromanipulator kontrolliert. Diese Sonden sind in der Lage, die Strahldichte von Gewebe in situ mit einer räumlichen Auflösung von 10-100 μm oder auf der Skala einzelner Zellen zu messen. Diese Sonden wurden verwendet, um das Licht zu charakterisieren, das die Fett- und Gehirnzellen 4 mm unter der Haut einer lebenden Maus erreicht, und um das Licht zu charakterisieren, das ähnliche Tiefen in lebendem algenreichem Riesenmuschelgewebe erreicht.

Introduction

Überraschenderweise haben Landtiere und flache Meeresbewohner genug Licht in ihrem Körper für die visuelle Physiologie und sogar die Photosynthese. Zum Beispiel werden die Lichtverhältnisse in der Mitte des Kopfes einer Maus (außerhalb der starken Hämoglobinabsorptionsbänder) um drei oder vier Größenordnungen relativ zur Außenwelt abgeschwächt. Dies entspricht in etwa der Unterschied zwischen den Lichtverhältnissen im Innen- und Außenbereich. Die Opazität eines Gewebes oder Materials aufgrund starker Streuung ist also nicht dasselbe wie die Opazität aufgrund starker Lichtabsorption. Licht kann sich in einem stark vorwärtsstreuenden System über große Entfernungen ausbreiten, ähnlich wie Licht, das sich durch aquatische Systeme mit hohen Konzentrationen von Zellen und Partikeln ausbreitet1. Diese Beobachtung ist besonders auffallend vor dem Hintergrund, dass Opsin-Proteine nahezu ubiquitär in allen Geweben aller Tiere exprimiert werden. Daher ist es wichtig zu verstehen, wie und wo Licht im lebenden Gewebe abgeschwächt und gestreut wird. Im Gegensatz zu aquatischen Systemen mit lebendem Gewebe ist es jedoch unmöglich, ein Instrument in die Wassersäule einzutauchen und Strahlungs- und Bestrahlungsstärkemessungen durchzuführen, und es ist eine neue Technik erforderlich.

Andere Methoden, die bisher zur Charakterisierung der Absorptions- und Streueigenschaften von lebendem Gewebe verwendet wurden, umfassen die Messung von Gewebereflexionssonden und/oder Ulbrichtschen Kugeln2,3, mikroskopische Methoden wie die konfokale Rastermikroskopie4, die Messung der Streuung von Laserlicht auf der Oberfläche5 und Modellierungstechniken wie der Monte-Carlo-Strahlungstransfer6. Die genannten experimentellen Methoden erfordern oft spezifische, große und teure Geräte oder detaillierte Kenntnisse über die Gewebestruktur und sind in der Regel nur begrenzt in ihrer Fähigkeit, die räumliche Struktur des Lichts tief im Gewebe zu charakterisieren.

Es gibt auch ähnliche sondenbasierte Verfahren, bei denen eine Injektionsnadel verwendet wird, um eine optische Faser durch Gewebe einzuführen 7,8,9. Unserer Erfahrung nach sind modifizierte Nadeln wirksam beim Durchstechen von Gewebe, erfordern jedoch erhebliche Kraft und reißen im Allgemeinen empfindliches Gewebe auf, wenn sie durch dicht gepackte Zellen gelangen. Daher erfordern diese Nadeln in der Regel einen chirurgischen Eingriff, bei dem mehr als ein Millimeter oder so in eine Gewebeschicht eingeführt wird. Die hier beschriebene Methode, bei der ein geschmierter, gezogener Glasträger verwendet wird, ist in der Lage, mit minimaler Verletzung des Gewebes und ohne zusätzliche Operation zwischen den Zellen zu gleiten.

Dieses Manuskript stellt eine Methode vor, die von der Arbeit von Jorgenson und Kollegen zur Messung von Licht in Algenmatten10,11 inspiriert ist, wobei glasgestützte optische Mikrosonden und tragbare Elektronik verwendet werden, die für die Untersuchung tief in dichtes Gewebe und für die Konstruktion und den Einsatz im Feld geeignet sind. Diese Sonden können so konstruiert werden, dass sie die skalare Bestrahlungsstärke (Licht, das aus allen Richtungen auf einen Punkt trifft) und die abwärts gerichtete Strahldichte (Licht, das eine horizontale Ebene schneidet) in lebendem Gewebe mit hoher räumlicher Auflösung charakterisieren. Diese Sonden wurden ursprünglich entwickelt, um den Strahlungstransport im Gewebe photosymbiotischer Riesenmuschelnzu messen 12. Standardmessungen der Absorption und Transmission des gesamten Gewebes reichten nicht aus, um die Photosyntheseleistung des Gewebes zu charakterisieren, da es einen großen Unterschied macht, ob das gesamte einfallende Licht von einigen wenigen Zellen absorbiert wird, die eine hohe Intensität an der Oberfläche des Gewebes aufweisen, oder von vielen Zellen, die eine geringe Intensität im gesamten Volumen des Gewebes aufweisen. In einem zweiten Projekt wurden diese Sonden verwendet, um die In-vivo-Bestrahlungsstärke im Gehirn einer Maus zu messen13,14 und so die Lichtumgebung von Opsinen zu charakterisieren, die tief im Gehirn exprimiert werden. Diese Mikrosonden sind sowohl klein als auch empfindlich genug, um die Bestrahlungsstärke im Gehirngewebe von Mäusen mit intaktem Fell, Haut und Knochen zu messen und zu zeigen, dass die physiologischen Lichtstärken leicht hoch genug sind, um die Opsine im tiefen Gehirn zu stimulieren.

Diese mikrooptische Sonde und der Messaufbau könnten für Forscher nützlich sein, die das Licht im Inneren von biologischem Gewebe quantifizieren und charakterisieren müssen, insbesondere für ein nuancierteres Verständnis der Photosynthese oder der Funktionen von Sehpigmenten, die außerhalb der Augen exprimiert werden. Diese Methode kann allein oder in Verbindung mit anderen Techniken verwendet werden, um die optischen Eigenschaften und die Lichtausbreitung in lebendem Gewebe zu geringen Kosten vollständig zu charakterisieren, mit kleinen, tragbaren Geräten, die im eigenen Haus gebaut werden, und mit aufgabenabhängig einstellbaren Parametern.

Protocol

Diese Studie entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften der Yale University in Bezug auf die Forschung an Wirbeltieren und wirbellosen Tieren. 1. Aufbau der optischen Mikrosonde Aufbau der Glashülse, Material: Pasteurpipette, 5,75 Zoll (siehe Materialtabelle)Montieren Sie die Glaspipette mit einer montierbaren Krokodilklemme (Materialtabelle) am breiten Ende, so dass das sich verjüngende Ende nach unten zum Boden ze…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Aufbau einer mikrooptischen Sonde, mit der die Bestrahlungsstärke des Auftriebs gemessen werden kann (das Licht, das aus einer Richtung auf einen Punkt trifft) oder, mit der Hinzufügung einer lichtstreuenden kugelförmigen Spitze, die skalare Bestrahlungsstärke (das Licht, das einen Punkt aus allen Richtungen erreicht). Diese Sonden können die Bestrahlungsstärke mit räumlicher Auflösung messen, die sich den Längenskalen einzelner Zellen im lebenden Gewebe annähert. D…

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur systematischen Charakterisierung der optischen Umgebung durch ein großes Volumen von lebendem Gewebe mit einer räumlichen Auflösung, die ungefähr der Skala einzelner Zellen entspricht. Diese kostengünstige, flexible und vor Ort handhabbare Methode könnte für alle Forscher nützlich sein, die die Ausbreitung von Licht in lebenden Systemen untersuchen. Erfahrungsgemäß erfordern diese Sonden im Vergleich zu bestehenden Methoden7 etwas mehr Übung …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Sanaz Vahidinia für die Vorstellung von Dr. Jorgensens Kollegen und seiner Arbeit. Diese Forschung wurde durch Zuschüsse des Army Research Office (Nr. W911NF-10-0139), des Office of Naval Research (durch den MURI-Preis Nr. N00014-09-1-1053) und des NSF-INSPIRE-Preises NSF-1343158 unterstützt.

Materials

1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 Edmond Optics 37-935 Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet McMaster-Carr 8505K754 For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp Anvil 99693 Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch Fisher Scientific NC9324386 For tissue sample
Butane Torch McMaster-Carr MT-51 Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens Thorlabs LLG5A1-A To collimate light source through liquid light guide
Compressed air McMaster-Carr 7437K35 For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue – liquid McMaster-Carr 66635A31 For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape McMaster-Carr 76455A21 For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper McMaster-Carr 4649A24 Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin Knox 10043000048679 For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete Fisher Scientific 13-678-20B Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle BD 320440 For applying glue
Isopropanol McMaster-Carr 54845T42 For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe Cole-Parmer SKU 33670-04 For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver Thorlabs LEDD1B For powering the UV LEDs
Light source for measurements Cole-Parmer UX-78905-05 Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage Edmond Optics 55-023 Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide Thorlabs LLG5-4T For light source in measurements
Magnetic feet Siskiyou MGB 8-32 For use with magnetic strips
Magnetic strips Siskiyou MS-6.0 For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1 Siskiyou MX10R 4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small WindowTint TOP01 For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard Edmond Optics 03-640 For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers Ocean Optics P-100-2-UV-VIS About 4 fibers are good to have
Plasma light source Thorlabs HPLS345 For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp McMaster-Carr 5070A11 Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes Thomas scientific 3488N10 Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades McMaster-Carr 3962A3 For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant Thomas scientific 1232E30 For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data Matlab Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software Avantes AvaSpec-2048L Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder Sigma Aldrich 718467-100G For making scattering sphere
Toolour tabletop clip Toolour Toolour0004 For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps mcMaster-Carr 51755A2 Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive Delo Photobond GB368 For making scattering sphere
UV light source Thorlabs M365FP1 Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source Thorlabs MCWHF2 For characterizing pulled fiber and scattering sphere

References

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Cite This Article
Holt, A. L., Gagnon, Y. L., Sweeney, A. M. An Intra-Tissue Radiometry Microprobe for Measuring Radiance In Situ in Living Tissue. J. Vis. Exp. (196), e64595, doi:10.3791/64595 (2023).

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