Microsonde de radiométrie intratissulaire pour mesurer la radiance in situ dans un tissu vivant
Summary
Dans cet article, une méthode de mesure de la radiance in situ dans les tissus vivants est décrite. Ce travail comprend des détails sur la construction de sondes à micro-échelle pour différentes mesures de radiance et d’irradiance, fournit des conseils pour le montage de tissus pour la caractérisation de la radiance et décrit les méthodes de calcul pour analyser les données résultantes.
Abstract
Les organismes semblent opaques en grande partie parce que leurs couches tissulaires externes se dispersent fortement à la lumière incidente; Les pigments fortement absorbants, tels que le sang, ont généralement des absorbances étroites, de sorte que le libre trajet moyen de la lumière à l’extérieur des pics d’absorbance peut être assez long. Comme les gens ne peuvent pas voir à travers les tissus, ils imaginent généralement que les tissus comme le cerveau, la graisse et les os contiennent peu ou pas de lumière. Cependant, les protéines d’opsine photosensibles sont exprimées dans bon nombre de ces tissus et leurs fonctions sont mal comprises. L’éclat interne aux tissus est également important pour comprendre la photosynthèse. Par exemple, les palourdes géantes absorbent fortement tout en maintenant une population dense d’algues profondément dans les tissus. La propagation de la lumière à travers des systèmes comme les sédiments et les biofilms peut être complexe, et ces communautés peuvent contribuer grandement à la productivité des écosystèmes. Par conséquent, une méthode de construction de microsondes optiques pour mesurer l’irradiance scalaire (flux de photons coupant un point) et l’irradiance descendante (flux de photons traversant un plan perpendiculairement) pour mieux comprendre ces phénomènes à l’intérieur des tissus vivants a été développée. Cette technique est également traitable dans les laboratoires de terrain. Ces micro-sondes sont fabriquées à partir de fibres optiques tirées thermiquement qui sont ensuite fixées dans des pipettes en verre tiré. Pour modifier l’acceptation angulaire de la sonde, une sphère de 10 à 100 μm d’époxy durcissable aux UV mélangée à du dioxyde de titane est ensuite fixée à l’extrémité d’une fibre tirée et coupée. La sonde est insérée dans un tissu vivant et sa position est contrôlée à l’aide d’un micromanipulateur. Ces sondes sont capables de mesurer in situ la radiance tissulaire à des résolutions spatiales de 10 à 100 μm ou à l’échelle de cellules individuelles. Ces sondes ont été utilisées pour caractériser la lumière atteignant les cellules adipeuses et cérébrales à 4 mm sous la peau d’une souris vivante et pour caractériser la lumière atteignant des profondeurs similaires dans le tissu de palourdes géantes riche en algues vivantes.
Introduction
Étonnamment, les animaux terrestres et les habitants des océans peu profonds ont suffisamment de lumière dans leur corps pour la physiologie visuelle et même la photosynthèse. Par exemple, les niveaux de lumière au centre de la tête d’une souris (en dehors des fortes bandes d’absorbance de l’hémoglobine) sont atténués de trois ou quatre ordres de grandeur par rapport au monde extérieur. C’est à peu près la différence entre les niveaux de lumière à l’intérieur et à l’extérieur. Ainsi, l’opacité d’un tissu ou d’un matériau due à une forte diffusion n’est pas la même que l’opacité due à une forte absorption de la lumière. La lumière peut continuer à se propager sur de longues distances dans un système fortement diffusant vers l’avant, semblable à la lumière qui se propage à travers les systèmes aquatiques avec de fortes concentrations de cellules et de particules1. Cette observation est particulièrement importante à la lumière du fait que les protéines d’opsine sont presque omniprésentes dans tous les tissus de tous les animaux. Ainsi, il est important de comprendre comment et où la lumière est atténuée et dispersée dans les tissus vivants. Cependant, contrairement aux systèmes aquatiques, avec des tissus vivants, il est impossible d’immerger un instrument dans la colonne d’eau et d’obtenir des mesures de radiance et d’irradiance, et une nouvelle technique est nécessaire.
D’autres méthodes précédemment utilisées pour caractériser les propriétés d’absorption et de diffusion des tissus vivants comprennent la mesure des sondes de réflectance tissulaire et/ou des sphères intégratrices2,3, les méthodes microscopiques telles que la microscopie confocale à balayage4, la mesure de la diffusion de la lumière laser sur la surface5, et les techniques de modélisation telles que le transfert radiatif de Monte Carlo6. Les méthodes expérimentales mentionnées nécessitent souvent un équipement spécifique, volumineux et coûteux ou des connaissances détaillées sur la structure tissulaire et sont généralement limitées dans leur capacité à caractériser la structure spatiale de la lumière profondément dans le tissu.
Il existe également des méthodes similaires basées sur des sondes qui utilisent une aiguille hypodermique pour insérer une fibre optique à travers le tissu 7,8,9. D’après notre expérience, les aiguilles modifiées sont efficaces pour percer les tissus, mais nécessitent une force considérable et déchirent généralement les tissus délicats lorsqu’elles passent à travers des cellules densément tassées. Par conséquent, ces aiguilles nécessitent généralement une intervention chirurgicale pour insérer plus d’un millimètre environ dans une couche de tissu. La méthode décrite ici, à l’aide d’un support en verre tiré lubrifié, est capable de glisser entre les cellules avec une blessure minimale du tissu et sans intervention chirurgicale supplémentaire.
Ce manuscrit présente une méthode inspirée des travaux de Jorgenson et de ses collègues sur la mesure de la lumière dans les tapis d’algues10,11, en utilisant des microsondes optiques à support de verre et une électronique portable qui se prêtent à sonder profondément dans les tissus denses et à la construction et à l’utilisation sur le terrain. Ces sondes peuvent être construites pour caractériser l’irradiance scalaire (la lumière frappant un point de toutes les directions) et la radiance descendante (lumière recoupant un plan horizontal) à l’intérieur des tissus vivants à des résolutions spatiales élevées. Ces sondes ont été développées à l’origine pour mesurer le transfert radiatif dans les tissus des palourdes géantes photosymbiotiques12. Les mesures standard de l’absorption et de la transmission du tissu total n’étaient pas suffisantes pour caractériser la performance photosynthétique du tissu, car il fait une grande différence si toute la lumière incidente est absorbée par quelques cellules subissant une intensité élevée à la surface du tissu ou de nombreuses cellules de faible intensité dans tout le volume du tissu. Dans un second projet, ces sondes ont été utilisées pour mesurer l’irradiance in vivo dans le cerveau d’une souris13,14, caractérisant ainsi l’environnement lumineux des opsines exprimées profondément dans le cerveau. Ces micro-sondes sont à la fois petites et suffisamment sensibles pour mesurer l’irradiance dans le tissu cérébral de souris avec toute la fourrure, la peau et les os intacts et démontrer que les niveaux de lumière physiologique sont facilement assez élevés pour stimuler les opsines cérébrales profondes.
Cette sonde micro-optique et cette installation de mesure pourraient être utiles aux chercheurs qui ont besoin de quantifier et de caractériser la lumière interne aux tissus biologiques, en particulier pour une compréhension plus nuancée de la photosynthèse ou des fonctions des pigments visuels exprimés à l’extérieur des yeux. Cette méthode peut être utilisée seule ou en conjonction avec d’autres techniques pour caractériser pleinement les propriétés optiques et la propagation de la lumière dans les tissus vivants à faible coût, avec de petits équipements portables construits en interne et avec des paramètres réglables en fonction de la tâche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une technique de caractérisation systématique de l’environnement optique à travers un grand volume de tissu vivant avec une résolution spatiale approximativement à l’échelle de cellules individuelles. Cette méthode peu coûteuse, flexible et traitable sur le terrain pourrait être utile à tous les chercheurs qui étudient la propagation de la lumière dans les systèmes vivants. D’après l’expérience, par rapport aux méthodes existantes7, ces sondes nécessit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Sanaz Vahidinia de nous avoir présenté les collègues du Dr Jorgensen et son travail. Cette recherche a été financée par des subventions du Bureau de recherche de l’armée (n° W911NF-10-0139), de l’Office of Naval Research (par le biais de la bourse MURI n00014-09-1-1053) et du prix NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
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