用于原 位 测量活组织辐射度的组织内辐射微探头
Summary
本文描述了一种原 位 测量活组织中辐射度的方法。这项工作包括用于不同辐射度和辐照度测量的微尺度探针的构造细节，为安装组织以表征辐射度提供了指导，并概述了分析结果数据的计算方法。
Abstract
生物体看起来不透明，主要是因为它们的外组织层对入射光强烈散射;强吸收性颜料（如血液）通常具有较窄的吸光度，因此吸光度峰外的平均光程可能很长。由于人们无法看穿组织，他们通常认为大脑、脂肪和骨骼等组织很少或没有光。然而，光响应性视蛋白在许多这些组织中表达，并且对其功能知之甚少。组织内部的辐射对于理解光合作用也很重要。例如，巨蛤具有很强的吸收能力，但在组织深处保持着密集的藻类种群。光通过沉积物和生物膜等系统传播可能很复杂，这些群落可能是生态系统生产力的主要贡献者。因此，已经开发了一种构建光学微探针的方法，用于测量标量辐照度（光子通量与点相交）和辐照度（光子通量垂直穿过平面），以更好地了解活组织内的这些现象。这种技术在现场实验室中也是可以处理的。这些微型探头由热拉光纤制成，然后将其固定在拉式玻璃移液器中。为了改变探头的角度接受度，然后将一个10-100μm大小的紫外光固化环氧树脂球与二氧化钛混合固定在拉动，修剪的纤维的末端。将探针插入活组织中，并使用显微操纵器控制其位置。这些探针能够以10-100μm的空间分辨率或单细胞规模测量原 位 组织辐射。这些探针用于表征到达活小鼠皮肤下方4毫米的脂肪和脑细胞的光，并表征在富含藻类的活巨蛤组织内到达相似深度的光。
Introduction
令人惊讶的是，陆地动物和浅海居民体内有足够的光进行视觉生理甚至光合作用。例如，小鼠头部中心（在强血红蛋白吸光带之外）的光照水平相对于外部世界衰减了三到四个数量级。这大致是室内和室外光线水平之间的差异。因此，由于强散射引起的组织或材料的不透明度与由于强光吸收引起的不透明度不同。光可以在强前向散射系统中保持长距离传播，类似于光在具有高浓度细胞和粒子的水生系统中传播1。鉴于视蛋白在所有动物的所有组织中几乎普遍表达，这一观察结果尤其突出。因此，了解光在活组织中如何以及在何处衰减和散射非常重要。然而，与水生系统不同，具有活组织，不可能将仪器浸入水柱中获得辐射度和辐照度测量值，因此需要一种新技术。
以前用于表征活组织的吸收和散射特性的其他方法包括测量组织反射探头和/或积分球2，3，显微镜方法，例如扫描共聚焦显微镜4，测量激光在表面上的扩散5，以及建模技术，例如蒙特卡罗辐射转移6.提到的实验方法通常需要特定的、大型的、昂贵的设备或关于组织结构的详细知识，并且通常它们表征组织深处光的空间结构的能力有限。
也有类似的基于探针的方法，使用皮下注射针将光纤插入组织7，8，9。根据我们的经验，改良针在穿刺组织方面是有效的，但需要相当大的力量，并且在通过密集堆积的细胞时通常会撕裂脆弱的组织。因此，这些针通常需要外科手术才能将超过一毫米左右插入组织层。这里描述的方法，使用润滑的，拉动的玻璃支架，能够在细胞之间滑动，对组织的伤害最小，并且无需额外的手术。
这份手稿介绍了一种受乔根森及其同事测量藻垫10，11 内光的工作启发的方法，使用玻璃支持的光学微探针和便携式电子设备，这些电子设备适合深入探测致密组织并在现场构建和使用。这些探针可以构建为以高空间分辨率表征活组织内的标量辐照度（从各个方向照射到一个点的光）和辐射度（光与水平面相交）。这些探针最初是为了测量光共生巨蛤12组织内的辐射转移而开发的。整个组织吸收和传输的标准测量不足以表征组织的光合作用性能，因为所有入射光是否被组织表面经历高强度的少数细胞吸收或许多细胞在整个组织体积中经历低强度，都会有很大的不同。在第二个项目中，这些探针用于测量小鼠大脑内的体内辐照度13，14，从而表征大脑深处表达的视蛋白的光环境。这些微探针既小又灵敏，足以测量小鼠脑组织内的辐照度，所有皮毛、皮肤和骨骼都完好无损，并证明生理光水平很容易高到足以刺激深部脑视蛋白。
这种微光学探针和测量装置对于需要量化和表征生物组织内部光的研究人员非常有用，特别是对于更细致入微地了解光合作用或眼睛外表达的视觉色素的功能。该方法可以单独使用或与其他技术结合使用，以低成本充分表征活组织内的光学特性和光传播，使用内部内置的小型便携式设备并具有与任务相关的可调参数。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了一种通过大量活组织系统表征光学环境的技术，其空间分辨率大约在单细胞的规模上。这种廉价、灵活且易于现场处理的方法可能对任何研究光在生命系统中传播的研究人员有用。根据经验，与现有方法7相比，这些探针需要更多的练习和技能来构建，但导致更少的组织损伤和更全面地表征更大体积致密组织的能力。
该方法包括四个部分。第一?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Sanaz Vahidinia向我们介绍Jorgensen博士的同事和他的工作。这项研究得到了陆军研究办公室（编号W911NF-10-0139），海军研究办公室（通过MURI奖励编号N00014-09-1-1053）和NSF-INSPIRE奖NSF-1343158的资助。
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
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