Una microsonda di radiometria intra-tissutale per misurare la radianza in situ nel tessuto vivente
Summary
In questo articolo, viene descritto un metodo per misurare la radianza in situ nei tessuti viventi. Questo lavoro include dettagli sulla costruzione di sonde su microscala per diverse misurazioni di radianza e irradianza, fornisce una guida per il montaggio del tessuto per la caratterizzazione della radianza e delinea metodi computazionali per analizzare i dati risultanti.
Abstract
Gli organismi appaiono opachi in gran parte perché i loro strati di tessuto esterno sono fortemente dispersi alla luce incidente; I pigmenti fortemente assorbenti, come il sangue, hanno tipicamente assorbanze strette, in modo tale che il percorso libero medio della luce al di fuori dei picchi di assorbanza può essere piuttosto lungo. Poiché le persone non possono vedere attraverso i tessuti, generalmente immaginano che tessuti come il cervello, il grasso e le ossa contengano poca o nessuna luce. Tuttavia, le proteine opsina fotosensibili sono espresse all’interno di molti di questi tessuti e le loro funzioni sono poco conosciute. La luminosità interna al tessuto è anche importante per comprendere la fotosintesi. Ad esempio, le vongole giganti assorbono fortemente ma mantengono una densa popolazione di alghe in profondità nel tessuto. La propagazione della luce attraverso sistemi come sedimenti e biofilm può essere complessa e queste comunità possono contribuire in modo significativo alla produttività dell’ecosistema. Pertanto, è stato sviluppato un metodo per costruire microsonde ottiche per misurare l’irraggiamento scalare (flusso di fotoni che interseca un punto) e l’irradianza downwelling (flusso di fotoni che attraversa un piano perpendicolarmente) per comprendere meglio questi fenomeni all’interno del tessuto vivente. Questa tecnica è trattabile anche nei laboratori sul campo. Queste microsonde sono costituite da fibre ottiche estratte dal calore che vengono poi fissate in pipette di vetro tirato. Per modificare l’accettazione angolare della sonda, una sfera di dimensioni 10-100 μm di resina epossidica polimerizzabile ai raggi UV mescolata con biossido di titanio viene quindi fissata all’estremità di una fibra tirata e tagliata. La sonda viene inserita nel tessuto vivente e la sua posizione viene controllata utilizzando un micromanipolatore. Queste sonde sono in grado di misurare la radianza dei tessuti in situ a risoluzioni spaziali di 10-100 μm o sulla scala di singole cellule. Queste sonde sono state utilizzate per caratterizzare la luce che raggiunge le cellule adipose e cerebrali 4 mm sotto la pelle di un topo vivente e per caratterizzare la luce che raggiunge profondità simili all’interno del tessuto di vongole giganti ricco di alghe viventi.
Introduction
Sorprendentemente, gli animali terrestri e gli abitanti dell’oceano poco profondi hanno abbastanza luce all’interno del loro corpo per la fisiologia visiva e persino la fotosintesi. Ad esempio, i livelli di luce al centro della testa di un topo (al di fuori delle forti bande di assorbimento dell’emoglobina) sono attenuati di tre o quattro ordini di grandezza rispetto al mondo esterno. Questa è all’incirca la differenza tra i livelli di luce all’interno e all’esterno. Quindi, l’opacità di un tessuto o materiale dovuta a una forte dispersione non è la stessa dell’opacità dovuta al forte assorbimento della luce. La luce può continuare a propagarsi su lunghe distanze in un sistema fortemente diffuso in avanti, simile alla luce che si propaga attraverso sistemi acquatici con alte concentrazioni di cellule e particelle1. Questa osservazione è particolarmente saliente alla luce del fatto che le proteine opsina sono espresse quasi ubiquitariamente in tutti i tessuti di tutti gli animali. Pertanto, è importante capire come e dove la luce viene attenuata e dispersa all’interno del tessuto vivente. Tuttavia, a differenza dei sistemi acquatici, con i tessuti viventi, è impossibile immergere uno strumento nella colonna d’acqua e ottenere misurazioni di radianza e irraggiamento, ed è necessaria una nuova tecnica.
Altri metodi precedentemente utilizzati per caratterizzare le proprietà di assorbimento e diffusione dei tessuti viventi includono la misurazione di sonde di riflettanza tissutale e / o l’integrazione di sfere2,3, metodi microscopici come la microscopia confocale a scansione4, la misurazione della diffusione della luce laser sulla superficie5 e tecniche di modellazione come il trasferimento radiativo Monte Carlo6. I metodi sperimentali menzionati spesso richiedono attrezzature specifiche, grandi e costose o conoscenze dettagliate sulla struttura del tessuto e sono generalmente limitati nella loro capacità di caratterizzare la struttura spaziale della luce in profondità all’interno del tessuto.
Esistono anche metodi simili basati su sonde che utilizzano un ago ipodermico per inserire una fibra ottica attraverso il tessuto 7,8,9. Nella nostra esperienza, gli aghi modificati sono efficaci nel perforare i tessuti, ma richiedono una forza considerevole e generalmente strappano i tessuti delicati quando passano attraverso cellule densamente imballate. Pertanto, questi aghi richiedono generalmente una procedura chirurgica per inserire più di un millimetro o giù di lì in uno strato di tessuto. Il metodo qui descritto, utilizzando un supporto di vetro lubrificato e tirato, è in grado di scivolare tra le cellule con ferite minime del tessuto e senza ulteriori interventi chirurgici.
Questo manoscritto presenta un metodo ispirato al lavoro di Jorgenson e colleghi sulla misurazione della luce all’interno delle stuoie algali10,11, utilizzando microsonde ottiche supportate da vetro ed elettronica portatile che sono suscettibili di sondare in profondità nel tessuto denso e di costruzione e uso sul campo. Queste sonde possono essere costruite per caratterizzare l’irradianza scalare (luce che colpisce un punto da tutte le direzioni) e la radianza discendente (luce che interseca un piano orizzontale) all’interno del tessuto vivente ad alte risoluzioni spaziali. Queste sonde sono state originariamente sviluppate per misurare il trasferimento radiativo all’interno del tessuto delle vongole giganti fotosimbionti12. Le misurazioni standard di assorbimento e trasmissione del tessuto totale non erano sufficienti per caratterizzare le prestazioni fotosintetiche del tessuto, poiché fa una grande differenza se tutta la luce incidente viene assorbita da poche cellule che sperimentano un’alta intensità sulla superficie del tessuto o molte cellule che sperimentano basse intensità in tutto il volume del tessuto. In un secondo progetto, queste sonde sono state utilizzate per misurare l’irradianza in vivo all’interno del cervello di un topo13,14, caratterizzando così l’ambiente luminoso delle opsine espresse in profondità nel cervello. Queste micro-sonde sono sia piccole che abbastanza sensibili da misurare l’irradianza all’interno del tessuto cerebrale del topo con tutta la pelliccia, la pelle e le ossa intatte e dimostrano che i livelli di luce fisiologica sono abbastanza alti da stimolare le opsine cerebrali profonde.
Questa sonda micro-ottica e la configurazione di misurazione potrebbero essere utili ai ricercatori che hanno bisogno di quantificare e caratterizzare la luce interna al tessuto biologico, in particolare per una comprensione più sfumata della fotosintesi o delle funzioni dei pigmenti visivi espressi al di fuori degli occhi. Questo metodo può essere utilizzato da solo o in combinazione con altre tecniche per caratterizzare completamente le proprietà ottiche e la propagazione della luce all’interno dei tessuti viventi a basso costo, con piccole apparecchiature portatili costruite internamente e con parametri regolabili dipendenti dal compito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo descrive una tecnica per caratterizzare sistematicamente l’ambiente ottico attraverso un grande volume di tessuto vivente con una risoluzione spaziale approssimativamente sulla scala delle singole cellule. Questo metodo economico, flessibile e trattabile sul campo potrebbe essere utile a tutti i ricercatori che studiano la propagazione della luce all’interno dei sistemi viventi. Per esperienza, rispetto ai metodi esistenti7, queste sonde richiedono un po ‘più di pratica e abilit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Sanaz Vahidinia per averci presentato i colleghi del Dr. Jorgensen e il suo lavoro. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dell’Ufficio di ricerca dell’esercito (n. W911NF-10-0139), dell’Ufficio di ricerca navale (attraverso il premio MURI n. N00014-09-1-1053) e del premio NSF-INSPIRE NSF-1343158.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
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