Canlı Dokuda Yerinde Işılığı Ölçmek için Bir Doku İçi Radyometri Mikroprobu
Summary
Bu yazıda, canlı dokuda in situ ışımayı ölçmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu çalışma, farklı parlaklık ve ışıma ölçümleri için mikro ölçekli probların yapımının ayrıntılarını içerir, ışımanın karakterizasyonu için doku montajı için rehberlik sağlar ve elde edilen verileri analiz etmek için hesaplama yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.
Abstract
Organizmalar büyük ölçüde opak görünür, çünkü dış doku katmanları gelen ışığa güçlü bir şekilde saçılır; Kan gibi kuvvetle emici pigmentler tipik olarak dar absorbanslara sahiptir, öyle ki absorbans zirvelerinin dışındaki ışığın ortalama serbest yolu oldukça uzun olabilir. İnsanlar dokuların içini göremedikleri için, genellikle beyin, yağ ve kemik gibi dokuların çok az ışık içerdiğini veya hiç ışık içermediğini hayal ederler. Bununla birlikte, ışığa duyarlı opsin proteinleri bu dokuların çoğunda eksprese edilir ve işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Fotosentezi anlamak için dokuya iç ışıma da önemlidir. Örneğin, dev istiridyeler güçlü bir şekilde emer, ancak dokunun derinliklerinde yoğun bir alg popülasyonunu korur. Tortular ve biyofilmler gibi sistemler aracılığıyla ışık yayılımı karmaşık olabilir ve bu topluluklar ekosistem verimliliğine büyük katkıda bulunabilir. Bu nedenle, canlı doku içindeki bu fenomenleri daha iyi anlamak için skaler ışımayı (bir noktayla kesişen foton akısı) ve aşağı inen ışımayı (bir düzlemi dik olarak geçen foton akısı) ölçmek için optik mikro-problar oluşturmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknik saha laboratuvarlarında da uygulanabilir. Bu mikro problar, daha sonra çekilmiş cam pipetlere sabitlenen ısı ile çekilen optik fiberlerden yapılmıştır. Probun açısal kabulünü değiştirmek için, titanyum dioksit ile karıştırılmış 10-100 μm boyutunda bir UV kürlenebilir epoksi küresi daha sonra çekilmiş, kesilmiş bir elyafın sonuna sabitlenir. Prob canlı dokuya yerleştirilir ve konumu bir mikromanipülatör kullanılarak kontrol edilir. Bu problar, in situ doku parlaklığını 10-100 μm’lik uzamsal çözünürlüklerde veya tek hücre ölçeğinde ölçebilir. Bu problar, canlı bir farenin derisinin 4 mm altındaki yağ ve beyin hücrelerine ulaşan ışığı karakterize etmek ve canlı alg bakımından zengin dev istiridye dokusu içinde benzer derinliklere ulaşan ışığı karakterize etmek için kullanıldı.
Introduction
Şaşırtıcı bir şekilde, kara hayvanları ve sığ okyanus sakinleri vücutlarında görsel fizyoloji ve hatta fotosentez için yeterli ışığa sahiptir. Örneğin, bir farenin kafasının ortasındaki ışık seviyeleri (güçlü hemoglobin absorbans bantlarının dışında), dış dünyaya göre üç veya dört büyüklük sırası ile zayıflatılır. Bu, kabaca iç ve dış mekanlardaki ışık seviyeleri arasındaki farktır. Bu nedenle, güçlü saçılma nedeniyle bir dokunun veya malzemenin opaklığı, güçlü ışık emilimi nedeniyle opaklık ile aynı değildir. Işık, yüksek konsantrasyonlarda hücre ve parçacıklara sahip sucul sistemlerde yayılan ışığa benzer şekilde, güçlü bir ileri saçılma sisteminde uzun mesafelerde yayılmaya devam edebilir1. Bu gözlem, opsin proteinlerinin tüm hayvanların tüm dokularında neredeyse her yerde ifade edildiği gerçeği ışığında özellikle dikkat çekicidir. Bu nedenle, ışığın canlı doku içinde nasıl ve nerede zayıfladığını ve dağıldığını anlamak önemlidir. Bununla birlikte, su sistemlerinden farklı olarak, canlı doku ile, bir aleti su kolonuna batırmak ve parlaklık ve parlaklık ölçümleri elde etmek imkansızdır ve yeni bir teknik gereklidir.
Canlı dokunun emilim ve saçılma özelliklerini karakterize etmek için daha önce kullanılan diğer yöntemler arasında doku yansıtma problarının ölçülmesi ve / veya kürelerin entegre edilmesi2,3, tarama konfokal mikroskobu4 gibi mikroskobik yöntemler, yüzeydeki lazer ışığının difüzyonunu ölçme5 ve Monte Carlo ışınım transferi6 gibi modelleme teknikleri bulunmaktadır. Bahsedilen deneysel yöntemler genellikle spesifik, büyük ve pahalı ekipman veya doku yapısı hakkında ayrıntılı bilgi gerektirir ve genellikle dokunun derinliklerindeki ışığın mekansal yapısını karakterize etme yetenekleriyle sınırlıdır.
7,8,9 dokusundan optik fiber yerleştirmek için hipodermik iğne kullanan benzer prob bazlı yöntemler de vardır. Deneyimlerimize göre, modifiye iğneler dokuyu delmede etkilidir, ancak önemli ölçüde kuvvet gerektirir ve genellikle yoğun bir şekilde paketlenmiş hücrelerden geçerken hassas dokuları yırtar. Bu nedenle, bu iğneler genellikle bir doku tabakasına bir milimetreden daha fazlasını yerleştirmek için cerrahi bir prosedür gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, yağlanmış, çekilmiş bir cam destek kullanarak, dokunun minimum yaralanmasıyla ve ek cerrahi olmadan hücreler arasında kayabilir.
Bu el yazması, Jorgenson ve meslektaşlarının alg paspasları10,11 içindeki ışığı ölçme konusundaki çalışmalarından esinlenerek, cam destekli optik mikroproblar ve yoğun dokunun derinliklerine inmeye ve sahada inşaat ve kullanıma uygun taşınabilir elektronikler kullanarak bir yöntem sunmaktadır. Bu problar, yüksek uzamsal çözünürlüklerde canlı doku içindeki skaler ışımayı (her yönden bir noktaya çarpan ışık) ve aşağı inen parlaklığı (yatay bir düzlemle kesişen ışık) karakterize etmek için inşa edilebilir. Bu problar başlangıçta fotosimbiyotik dev istiridye dokusu içindeki ışınım transferini ölçmek için geliştirilmiştir12. Toplam dokunun emilimi ve iletiminin standart ölçümleri, dokunun fotosentetik performansını karakterize etmek için yeterli değildi, çünkü tüm gelen ışığın, dokunun yüzeyinde yüksek yoğunluk yaşayan birkaç hücre tarafından mı yoksa doku hacmi boyunca düşük yoğunluklar yaşayan birçok hücre tarafından mı emildiği büyük bir fark yaratıyor. İkinci bir projede, bu problar bir farenin beynindeki in vivo ışımayı ölçmek için kullanıldı13,14, böylece beynin derinliklerinde ifade edilen opsinlerin ışık ortamını karakterize etti. Bu mikro problar, fare beyin dokusundaki parlaklığı tüm kürk, cilt ve kemik bozulmadan ölçecek kadar küçük ve hassastır ve fizyolojik ışık seviyelerinin derin beyin opsinlerini uyaracak kadar yüksek olduğunu göstermektedir.
Bu mikro-optik prob ve ölçüm kurulumu, biyolojik dokunun içindeki ışığı ölçmek ve karakterize etmek isteyen araştırmacılar için, özellikle fotosentezin veya gözlerin dışında ifade edilen görsel pigmentlerin işlevlerinin daha nüanslı bir şekilde anlaşılması için yararlı olabilir. Bu yöntem, canlı doku içindeki optik özellikleri ve ışık yayılımını düşük maliyetle, şirket içinde inşa edilmiş küçük taşınabilir ekipmanlarla ve göreve bağlı ayarlanabilir parametrelerle tam olarak karakterize etmek için tek başına veya diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, optik ortamı, yaklaşık olarak tek hücreler ölçeğinde uzamsal bir çözünürlüğe sahip büyük hacimli bir canlı doku aracılığıyla sistematik olarak karakterize etmek için bir tekniği tanımlar. Bu ucuz, esnek ve sahada izlenebilir yöntem, ışığın canlı sistemler içinde yayılmasını inceleyen herhangi bir araştırmacı için yararlı olabilir. Deneyimlere göre, mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında7, bu problar inşa etmek için biraz daha fazla p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bizi Dr. Jorgensen’in meslektaşlarına ve çalışmalarına tanıttığı için Sanaz Vahidinia’ya teşekkür ediyor. Bu araştırma, Ordu Araştırma Ofisi (no. W911NF-10-0139), Deniz Araştırmaları Ofisi (MURI ödül no. N00014-09-1-1053 aracılığıyla) ve NSF-INSPIRE ödülü NSF-1343158 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue – liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393 (2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309 (2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316 (2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678 (2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
