Påvisning av polyfunksjonelle T-celler hos barn vaksinert med japansk encefalittvaksine via flowcytometriteknikken

Summary

Denne protokollen kombinerer ex vivo stimulering og flowcytometri for å analysere polyfunksjonelle T-celle (T PF) profiler i perifere mononukleære celler i blodet (PBMCs₎ innen japanske encefalittvirus (JEV)-vaksinerte barn. Deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPFer ble testet for å gi en referanse for lignende studier.

Abstract

T-cellemediert immunitet spiller en viktig rolle i å kontrollere flavivirusinfeksjon, enten etter vaksinasjon eller etter naturlig infeksjon. “Kvaliteten” til en T-celle må vurderes etter funksjon, og høyere funksjon er forbundet med kraftigere immunforsvar. T-celler som samtidig kan produsere to eller flere cytokiner eller kjemokiner på enkeltcellenivå kalles polyfunksjonelle T-celler (T_PFs), som formidler immunresponser gjennom en rekke molekylære mekanismer for å uttrykke degranulasjonsmarkører (CD107a) og utskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2, eller makrofag inflammatorisk protein (MIP)-1α. Det er økende bevis på at T_PFs er nært knyttet til vedlikehold av langsiktig immunminne og beskyttelse, og at deres økte andel er en viktig markør for beskyttende immunitet og er viktig i effektiv kontroll av virusinfeksjon og reaktivering. Denne evalueringen gjelder ikke bare for spesifikke immunresponser, men også for vurdering av kryssreaktive immunresponser. Her, med det japanske encefalittviruset (JEV) som et eksempel, ble deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke T_PF-erprodusert av perifere mononukleære celler av barn vaksinert mot japansk encefalitt testet for å gi en referanse for lignende studier.

Introduction

Japansk encefalittvirus (JEV) er et viktig myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus i Flaviviridae-familien ¹. Mange land i Asia og Stillehavsområdet har lenge stått overfor enorme folkehelseutfordringer på grunn av den enorme sykdomsbyrden forårsaket av japansk encefalitt (JE), men dette har forbedret seg dramatisk med den økende tilgjengeligheten av ulike typer vaksinasjoner². Adaptive beskyttende immunresponser fremkalt av naturlig infeksjon eller vaksinasjon bidrar til forebygging og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemediert immunitet klassifiseres som adaptiv immunitet, og induksjon av førstnevnte har alltid vært ansett som en sentral strategi i vaksinedesign, om enn med relativt begrenset forståelse i de siste³. Imidlertid har rollen som T-cellemediert immunitet for å begrense flavivirusspredning og virusklarering blitt stadig mer fokusert på og grundig studert⁴. Videre er T-celleimmunitet ikke bare uunnværlig i JEV-spesifikke antivirale responser, men spiller også en fremtredende rolle i kryssbeskyttelse mot sekundær infeksjon med heterologe flavivirus, noe som er vist i tidligere studier⁵. Det spekuleres i at denne effekten kan omgå potensielle antistoffmedierte forbedringseffekter ved infeksjon⁵. Merk at slik kryssreaktiv T-celleimmunitet er viktig, spesielt i fravær av vaksiner og antivirale legemidler mot flavivirus. Selv om mange studier har blitt utført for å bestemme bidraget fra T-celler i JEV-infeksjon med hensyn til CD4 ⁺ og CD8 ⁺ T-celler^6,7, forblir de respektive linjene som utskiller cytokiner og deres funksjonelle diversifisering ubestemt^, noe som betyr at belysningen av de nøyaktige funksjonene til hjelper- og morder-T-celler hindres.

Omfanget av deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten på T-celleresponser. CD4⁺ eller CD8⁺ T-celler som kan gi to eller flere funksjoner, inkludert cytokinsekresjon og degranulering, karakteriseres som polyfunksjonelle T-celler (T_PFs) ved spesifikk stimulering på enkeltcellenivå⁸. CD4⁺ T-celler som produserer enkle eller multiple cytokiner kan ha ulike effekter og immunminner. For eksempel er IL-2+ IFN-γ⁺ CD4+ T-celler mer sannsynlig å danne en langsiktig effektiv beskyttelsesrespons enn IL-2+ CD4⁺ T-celler⁹, som kan brukes som en viktig parameter for å evaluere vaksinasjonseffekten. Frekvensen av IL-2+ IFN-γ⁺ CD4⁺ T-celler er økt hos pasienter med langvarig ikke-progresjon av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), mens ^CD4+ T-celler hos pasienter med AIDS-progresjon er mer tilbøyelige til å produsere IFN-γ alene på grunn av den fremmende effekten av IL-2 på T-celleproliferasjon¹⁰. Videre ble en undergruppe av IL-2⁺ IFN-γ+ TNF-α⁺ vist å overleve langsiktig in vivo og synergistisk fremme drapsfunksjonen¹¹. Selv om CD8+ T-celler er mer sannsynlig å utvise cytotoksisk aktivitet, er noen CD4⁺ T-celler også utstyrt med cytotoksisk aktivitet som et indirekte påvist uttrykk for overflate CD107a-molekyler¹². I tillegg uttrykker visse T-celleundergrupper kjemokinen MIP-1α, som ofte utskilles av monocytter for å delta i T-cellemediert nøytrofilrekruttering¹³. På samme måte kan CD8⁺ T_PF-erogså brukes til å karakterisere allsidigheten til markørene ovenfor. Studier har vist at prime-boost-strategien effektivt kan indusere en lengre periode med T_{PF-beskyttende} effekter¹³, noe som kan forbedre beskyttelsen fremkalt av vaksinasjon. Et sentralt trekk ved undersøkelse av immunsystemet er hukommelses-T-cellers evne til å legge til rette for sterkere, raskere og mer effektive responser på sekundære virale utfordringer enn naive T-celler. Effektorminne T-celler (T_EM) og sentrale minne T-celler (T_CM) er viktige T-celleundergrupper som ofte differensieres av det sammensatte uttrykket av CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA¹⁴. T_CM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har en tendens til å lokalisere seg i sekundært lymfoid vev, mens T_EM (CD27- CD45RO⁺ eller CCR7- CD45RA^–) lokaliserer i lymfoid og perifert vev^15,16. T_EM gir umiddelbart, men ikke vedvarende forsvar, mens T_CM opprettholder responsen ved å spre seg i sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer¹⁷. Således, gitt at minneceller kan formidle spesifikke og effektive tilbakekallingsresponser på virus, oppstår det spørsmål om bidraget fra denne delmengden av polyfunksjoner.

Med utviklingen av flowcytometriteknologi har det blitt vanlig å samtidig oppdage markører på mer enn 10 klynger, fenotyper og differensieringsantigener, noe som er gunstig for mer rikelig å kommentere de funksjonelle immunologiske egenskapene på individuelle T-celler for å redusere feiltolkning og vanskeligheter med å forstå T-cellefenotyper. Denne studien brukte ex vivo-stimulering og flowcytometri for å analysere T_PF-profiler i mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) hos JEV-vaksinerte barn. Ved å bruke denne tilnærmingen vil forståelsen av kort- og langsiktig JEV-spesifikk og til og med kryssreaktiv T-celleimmunitet indusert av vaksinasjon bli utvidet.

Protocol

Etisk godkjenning for denne studien ble innhentet av etikkutvalget for Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University (Godkjenningsnummer: 2020-k-85). Frivillige ble rekruttert fra Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University. Perifere venøse blodprøver ble tatt fra tilsynelatende friske barn (2 år) som tidligere hadde fått primtall og økt vaksinasjon med levende-svekket JE SA14-14-2-vaksine i mindre enn et halvt år (JE-vaksinerte barn, n = 5) og uvaksinerte barn (6 måneder, n = 5). Informert s…

Representative Results

Figur 1 viser gating-strategien som brukes til å dele TCM eller TEM av CD8 + eller CD4 + T-celler fra en representativ JEV-stimuleringsgruppe av JE-vaksinerte barn. FSC-A / SSC-A dotplottet brukes til å identifisere lymfocytter, og FSC-A / FSC-W dotplottet brukes til å identifisere enkeltceller. Levedyktige celler velges på live / dead / SSC-A dot plot. CD3/SSC-A-punktplottet brukes til å identifisere CD3+ T-cellene. CD4/CD8-punktdi…

Discussion

Denne protokollen representerer en gjennomførbar flowcytometribasert deteksjonsmetode for T_PF-profiler i PBMC-ene til barn vaksinert med JEV-vaksinen SA14-14-2. Denne studien brukte pbmc i venøst blod hos både vaksinerte og uvaksinerte barn som forskningsmateriale. Ved stimulering av PBMC med JEV-antigenet kan de forsterkede antigenspesifikke T_PF-enekarakteriseres ved flerfarget flowcytometriantistofffarging. Sammenlignet med den konvensjonelle enzymbundne immunospotanalysemetoden, er flowcytomet…

Materials

anti-human CD28	Biolegend	302934	Antibody
anti-human CD49d	Biolegend	304339	Antibody
APC anti-human MIP-1α	BD	551533	Fluorescent antibody
Automated cell counter	BIO RAD	TC20	Cell count
BD FACSymphony A5	BD	A5	flow Cytometry
BUV395 anti-human CD4	BD	563550	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CCR7	BD	741786	Fluorescent antibody
BUV737 anti-human CD27	BD	612829	Fluorescent antibody
BV421 anti-human CD8	Biolegend	344748	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RA	BD	566114	Fluorescent antibody
BV480 anti-human CD45RO	BD	566143	Fluorescent antibody
BV605 anti-human CD107a	Biolegend	328634	Fluorescent antibody
BV650 anti-human CD3	BD	563999	Fluorescent antibody
BV785 anti-human IL-2	Biolegend	500348	Fluorescent antibody
Centrifuge Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL centrifuge tube
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD	554714	Cell fixation and permeabilization
Density gradient medium	Dakewe	DKW-KLSH-0100	Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium
FITC anti-human IFN-γ	Biolegend	502506	Fluorescent antibody
Gibco Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000-044	Fetal Bovine Serum
Gibco RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	22400089	cell culture medium
High-speed centrifuge	Sigma	3K15	Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube
High-speed centrifuge	Eppendorf	5424R	Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube
Microcentrifuge tubes	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL microcentrifuge tube
PE anti-human TNF-α	Biolegend	502909	Fluorescent antibody
Phosphate Buffered Saline (PBS)	BI	02-024-1ACS	PBS
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug)	BD	555029	blocks intracellular protein transport processes
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)	BD	554724	blocks intracellular protein transport processes
Round-bottom test tube	BD Falcon	352235	5 mL test tube
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit	Beyotime	C0011	Trypan Blue Staining
Zombie NIR Fixable Viability Dye	Biolegend	423106	Dead cell stain