Denne protokollen kombinerer ex vivo stimulering og flowcytometri for å analysere polyfunksjonelle T-celle (T PF) profiler i perifere mononukleære celler i blodet (PBMCs) innen japanske encefalittvirus (JEV)-vaksinerte barn. Deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPFer ble testet for å gi en referanse for lignende studier.
T-cellemediert immunitet spiller en viktig rolle i å kontrollere flavivirusinfeksjon, enten etter vaksinasjon eller etter naturlig infeksjon. “Kvaliteten” til en T-celle må vurderes etter funksjon, og høyere funksjon er forbundet med kraftigere immunforsvar. T-celler som samtidig kan produsere to eller flere cytokiner eller kjemokiner på enkeltcellenivå kalles polyfunksjonelle T-celler (TPFs), som formidler immunresponser gjennom en rekke molekylære mekanismer for å uttrykke degranulasjonsmarkører (CD107a) og utskille interferon (IFN)-γ, tumornekrosefaktor (TNF)-α, interleukin (IL)-2, eller makrofag inflammatorisk protein (MIP)-1α. Det er økende bevis på at TPFs er nært knyttet til vedlikehold av langsiktig immunminne og beskyttelse, og at deres økte andel er en viktig markør for beskyttende immunitet og er viktig i effektiv kontroll av virusinfeksjon og reaktivering. Denne evalueringen gjelder ikke bare for spesifikke immunresponser, men også for vurdering av kryssreaktive immunresponser. Her, med det japanske encefalittviruset (JEV) som et eksempel, ble deteksjonsmetoden og flowcytometrifargeskjemaet til JEV-spesifikke TPF-erprodusert av perifere mononukleære celler av barn vaksinert mot japansk encefalitt testet for å gi en referanse for lignende studier.
Japansk encefalittvirus (JEV) er et viktig myggbårent virus som tilhører slekten Flavivirus i Flaviviridae-familien 1. Mange land i Asia og Stillehavsområdet har lenge stått overfor enorme folkehelseutfordringer på grunn av den enorme sykdomsbyrden forårsaket av japansk encefalitt (JE), men dette har forbedret seg dramatisk med den økende tilgjengeligheten av ulike typer vaksinasjoner2. Adaptive beskyttende immunresponser fremkalt av naturlig infeksjon eller vaksinasjon bidrar til forebygging og antiviral regulering. Humoral immunitet og cellemediert immunitet klassifiseres som adaptiv immunitet, og induksjon av førstnevnte har alltid vært ansett som en sentral strategi i vaksinedesign, om enn med relativt begrenset forståelse i de siste3. Imidlertid har rollen som T-cellemediert immunitet for å begrense flavivirusspredning og virusklarering blitt stadig mer fokusert på og grundig studert4. Videre er T-celleimmunitet ikke bare uunnværlig i JEV-spesifikke antivirale responser, men spiller også en fremtredende rolle i kryssbeskyttelse mot sekundær infeksjon med heterologe flavivirus, noe som er vist i tidligere studier5. Det spekuleres i at denne effekten kan omgå potensielle antistoffmedierte forbedringseffekter ved infeksjon5. Merk at slik kryssreaktiv T-celleimmunitet er viktig, spesielt i fravær av vaksiner og antivirale legemidler mot flavivirus. Selv om mange studier har blitt utført for å bestemme bidraget fra T-celler i JEV-infeksjon med hensyn til CD4 + og CD8 + T-celler6,7, forblir de respektive linjene som utskiller cytokiner og deres funksjonelle diversifisering ubestemt, noe som betyr at belysningen av de nøyaktige funksjonene til hjelper- og morder-T-celler hindres.
Omfanget av deres antivirale forsvar bestemmer kvaliteten på T-celleresponser. CD4+ eller CD8+ T-celler som kan gi to eller flere funksjoner, inkludert cytokinsekresjon og degranulering, karakteriseres som polyfunksjonelle T-celler (TPFs) ved spesifikk stimulering på enkeltcellenivå8. CD4+ T-celler som produserer enkle eller multiple cytokiner kan ha ulike effekter og immunminner. For eksempel er IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler mer sannsynlig å danne en langsiktig effektiv beskyttelsesrespons enn IL-2+ CD4+ T-celler9, som kan brukes som en viktig parameter for å evaluere vaksinasjonseffekten. Frekvensen av IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-celler er økt hos pasienter med langvarig ikke-progresjon av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS), mens CD4+ T-celler hos pasienter med AIDS-progresjon er mer tilbøyelige til å produsere IFN-γ alene på grunn av den fremmende effekten av IL-2 på T-celleproliferasjon10. Videre ble en undergruppe av IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ vist å overleve langsiktig in vivo og synergistisk fremme drapsfunksjonen11. Selv om CD8+ T-celler er mer sannsynlig å utvise cytotoksisk aktivitet, er noen CD4+ T-celler også utstyrt med cytotoksisk aktivitet som et indirekte påvist uttrykk for overflate CD107a-molekyler12. I tillegg uttrykker visse T-celleundergrupper kjemokinen MIP-1α, som ofte utskilles av monocytter for å delta i T-cellemediert nøytrofilrekruttering13. På samme måte kan CD8+ TPF-erogså brukes til å karakterisere allsidigheten til markørene ovenfor. Studier har vist at prime-boost-strategien effektivt kan indusere en lengre periode med TPF-beskyttende effekter13, noe som kan forbedre beskyttelsen fremkalt av vaksinasjon. Et sentralt trekk ved undersøkelse av immunsystemet er hukommelses-T-cellers evne til å legge til rette for sterkere, raskere og mer effektive responser på sekundære virale utfordringer enn naive T-celler. Effektorminne T-celler (TEM) og sentrale minne T-celler (TCM) er viktige T-celleundergrupper som ofte differensieres av det sammensatte uttrykket av CD27 / CD45RO eller CCR7 / CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) har en tendens til å lokalisere seg i sekundært lymfoid vev, mens TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA–) lokaliserer i lymfoid og perifert vev15,16. TEM gir umiddelbart, men ikke vedvarende forsvar, mens TCM opprettholder responsen ved å spre seg i sekundære lymfoide organer og generere nye effektorer17. Således, gitt at minneceller kan formidle spesifikke og effektive tilbakekallingsresponser på virus, oppstår det spørsmål om bidraget fra denne delmengden av polyfunksjoner.
Med utviklingen av flowcytometriteknologi har det blitt vanlig å samtidig oppdage markører på mer enn 10 klynger, fenotyper og differensieringsantigener, noe som er gunstig for mer rikelig å kommentere de funksjonelle immunologiske egenskapene på individuelle T-celler for å redusere feiltolkning og vanskeligheter med å forstå T-cellefenotyper. Denne studien brukte ex vivo-stimulering og flowcytometri for å analysere TPF-profiler i mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) hos JEV-vaksinerte barn. Ved å bruke denne tilnærmingen vil forståelsen av kort- og langsiktig JEV-spesifikk og til og med kryssreaktiv T-celleimmunitet indusert av vaksinasjon bli utvidet.
Denne protokollen representerer en gjennomførbar flowcytometribasert deteksjonsmetode for TPF-profiler i PBMC-ene til barn vaksinert med JEV-vaksinen SA14-14-2. Denne studien brukte pbmc i venøst blod hos både vaksinerte og uvaksinerte barn som forskningsmateriale. Ved stimulering av PBMC med JEV-antigenet kan de forsterkede antigenspesifikke TPF-enekarakteriseres ved flerfarget flowcytometriantistofffarging. Sammenlignet med den konvensjonelle enzymbundne immunospotanalysemetoden, er flowcytomet…
The authors have nothing to disclose.
RW ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. ble støttet av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |