الثقافة طويلة الأجل لالتهاب Caenorhabditis elegans الفردي على الوسائط الصلبة لمراقبة التألق الطولي والتدخلات البعيدة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لزرع الديدان الخيطية الفردية المعزولة على وسائط صلبة لتتبع المعلمات الفسيولوجية مدى الحياة والقياس الكمي الفلوري. يتضمن نظام الاستزراع هذا حاجزا من حمض النخيل حول آبار دودة واحدة لمنع الحيوانات من الفرار ، مما يسمح باستخدام التدخلات المكروهة ، بما في ذلك البكتيريا المسببة للأمراض والضغوطات الكيميائية.
Abstract
تستخدم Caenorhabditis elegans على نطاق واسع لدراسة بيولوجيا الشيخوخة. تتمثل الممارسة القياسية في دراسات الشيخوخة C. elegans في استزراع مجموعات من الديدان على وسائط نمو الديدان الخيطية الصلبة (NGM) ، مما يسمح بجمع البيانات على مستوى السكان بكفاءة للبقاء على قيد الحياة والأنماط الظاهرية الفسيولوجية الأخرى ، وأخذ العينات الدورية من المجموعات الفرعية لتحديد كمية العلامات الحيوية الفلورية. تتمثل القيود المفروضة على هذا النهج في عدم القدرة على (1) تتبع الديدان الفردية بمرور الوقت لتطوير مسارات العمر للأنماط الظاهرية ذات الأهمية و (2) مراقبة المؤشرات الحيوية الفلورية مباشرة في سياق بيئة الاستزراع. تستخدم مناهج الاستزراع البديلة الاستزراع السائل أو الموائع الدقيقة لمراقبة الحيوانات الفردية بمرور الوقت ، وفي بعض الحالات بما في ذلك القياس الكمي للتألق ، مع المفاضلة بين بيئة الاستزراع تختلف سياقا عن NGM الصلب. WorMotel هو جهاز متعدد الآبار دقيق الصنع تم وصفه سابقا لزراعة الديدان المعزولة على NGM الصلب. يتم الاحتفاظ بكل دودة في بئر يحتوي على NGM صلب محاط بخندق مملوء بكبريتات النحاس ، وهو طارد ملامس ل C. elegans ، مما يسمح بالمراقبة الطولية للحيوانات الفردية. نجد كبريتات النحاس غير كافية لمنع الديدان من الفرار عند تعرضها لتدخلات مكروهة شائعة في أبحاث الشيخوخة ، بما في ذلك تقييد النظام الغذائي والبكتيريا المسببة للأمراض والعوامل الكيميائية التي تحفز الإجهاد الخلوي. يتم تشكيل الأجهزة متعددة الآبار أيضا من polydimethylsiloxane ، والتي تنتج قطعا أثرية عالية الخلفية في التصوير الفلوري. يصف هذا البروتوكول نهجا جديدا لاستزراع الديدان المستديرة المعزولة على NGM الصلبة باستخدام صواني البوليسترين الدقيقة المتاحة تجاريا ، والمصممة أصلا لكتابة مستضد الكريات البيض البشرية (HLA) ، مما يسمح بقياس البقاء على قيد الحياة ، والأنماط الظاهرية الفسيولوجية ، والتألق عبر العمر. يمنع حاجز حمض النخيل الديدان من الفرار ، حتى في وجود ظروف مكروهة. يمكن لكل طبق استزراع ما يصل إلى 96 حيوانا ويتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من الظروف ، بما في ذلك القيود الغذائية ، والحمض النووي الريبي ، والمواد المضافة الكيميائية ، وهو متوافق مع الأنظمة الآلية لجمع بيانات العمر والنشاط.
Introduction
C. elegans هي كائن نموذجي قوي للبحث في علم الوراثة ، والبيولوجيا الخلوية ، والبيولوجيا الجزيئية ، لأنها يمكن استزراعها بسهولة في المختبر ، ولها وقت وعمر جيل قصير ، وتشترك في درجة عالية من تماثل البروتين مع الثدييات ، ولها بنية جسم شفافة تسمح في الجسم الحي بتصور البروتينات والأصباغ الفلورية1. نتيجة للاستخدام طويل الأمد ل C. elegans كنظام نموذجي رئيسي في مجموعة من المجالات ، بما في ذلك علم الأحياء التنموي والشيخوخة ، فإن نموها وتطورها مفهومان جيدا ، وقد تم تسلسل جينومها بالكامل ، وتم إنشاء مجموعة من الأدوات الوراثية القوية ، بما في ذلك مكتبات تغذية RNAi على مستوى الجينوم والآلاف من السلالات الطافرة والمحورة وراثيا. تاريخيا ، تزرع C. elegans كمجموعات على وسائط نمو نيماتودا أجار صلبة (NGM) ، ويتم تقييم الأنماط الظاهرية يدويا إما عن طريق الملاحظة المباشرة أو عن طريق التصوير والتحليل النهائي. يستخدم المجهر الفلوري لالتقاط مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية الجزيئية باستخدام الأصباغ أو علامات الفلورسنت المعبر عنها وراثيا في C. elegans الفردية. يتضمن التصوير بالفلورسنت عادة تثبيت أو شله على شرائح تحتوي على وسادات أغاروز رقيقة ، وهو أمر غازي وغالبا ما يكون مميتا. كما أنه ينطوي على استخدام المواد الكيميائية ، مثل ليفاميزول أو أزيد الصوديوم ، والتي يمكن أن تتداخل مع العملية الجزيئية محل الاهتمام 2,3. تسمح هذه الأساليب مجتمعة بجمع بيانات مستعرضة على مستوى السكان عبر مجموعة واسعة من الأنماط الظاهرية ، ولكنها لا تسمح بتتبع الحيوانات الفردية بمرور الوقت.
في السنوات الأخيرة ، ظهرت عدة طرق لزراعة C. elegans المعزولة ، مما يسمح للباحثين بالتقاط التغيرات الديناميكية في الأنماط الظاهرية الفسيولوجية والجزيئية للحيوانات بمرور الوقت باستخدام تقنيات التصوير الجديدة. إحدى فئات نهج ثقافة C. elegans هي أجهزة الموائع الدقيقة ، بما في ذلك WormFarm4 ، وشريحة Nemalife5 ، وشريحة “السلوك” بواسطة Chronis et al.6 ، من بين العديد من الأجهزة الأخرى7،8،9. ترتبط بهذه الطرق الاستزراع القائمة على السائل ، والتي تستخدم لوحات متعددة الآبار لتوصيف الديدان الفردية أو المجموعات الصغيرة بمرور الوقت10,11. توفر الموائع الدقيقة وأنظمة الصفائح الدقيقة قياسات كمية ممتازة لاستجابات النمط الظاهري في C. elegans وصولا إلى واحد ، لكن بيئة الاستزراع تمثل قيدا رئيسيا. تم الانتهاء من الغالبية العظمى من الأبحاث السابقة في C. elegans ، لا سيما في مجال الشيخوخة ، على وسائط صلبة قائمة على أجار. تتسبب الثقافة السائلة في سباحة C. elegans بشكل مستمر وتمثل سياقا بيئيا متميزا يمكن أن يغير البيولوجيا الأساسية. على سبيل المثال ، الحيوانات المستزرعة في الوسائط السائلة قد غيرت بشكل كبير محتوى الدهون والتعبير الجيني – خاصة بالنسبة للجينات المشاركة في الاستجابة للإجهاد – بالنسبة للحيوانات المستزرعة على NGM12،13 الصلبة القائمة على أجار. تتضمن فئة بديلة من طرق التصوير أحادية الحيوان أجهزة polydimethylsiloxane (PDMS) التي تعزل الحيوانات الفردية على وسائط صلبة ، في محاولة لمحاكاة البيئة القياسية التي تعاني منها الديدان المستزرعة على NGM الصلب في ثقافة المجموعة على ألواح بتري. WorMotel هو جهاز PDMS مكون من 240 بئرا مصمم لتربية الحيوانات الفردية على وسائط صلبة. يتم ملء كل بئر ب NGM معدل باستخدام أغاروز منخفض الذوبان بدلا من الآجار وبذره بالأغذية البكتيرية ، مما يخلق بيئة وسائط صلبة مماثلة لنظام الاستزراع الأكثر شيوعا باستخدام ألواح بتري. جدران البئر مستديرة ، مما يسمح بتصوير كل بغض النظر عن موقعه في البئر (تجنب الحجب البصري الذي يسببه بالقرب من جدار في لوحة متعددة الآبار). تستخدم كبريتات النحاس في خندق ضيق يحيط بكل بئر كرادع لإبقاء الحيوانات في آبارها14,15. يتمثل أحد قيود هذا النهج في أن كبريتات النحاس غير فعالة في منع الديدان من الفرار عند وجود ظروف بيئية مكروهة ، بما في ذلك القيود الغذائية أو البكتيريا المسببة للأمراض أو المواد الكيميائية التي تحفز الإجهاد الخلوي (مثل الباراكوات).
النظام الثاني الذي يستخدم الوسائط الصلبة هو Worm Corral ، الذي يستخدم هيدروجيل لإنشاء بيئة صغيرة محكمة الغلق لكل دودة على شريحة ، مما يسمح بمراقبة طويلة الأجل للحيوانات المعزولة بشكل فردي16. أحد القيود الرئيسية هو أن الحيوانات يجب أن تكون مغلقة في البيئة كبيض ، مما يتطلب استخدام الحيوانات العقيمة لمنع التكاثر ، وقصر العلاجات الدوائية على تطبيق واحد. يمكن إجراء تجارب دوائية متعددة الجرعات في WorMotel إما عن طريق إجراء جولات متعددة من التعرض قبل نقل الديدان إلى الجهاز أو عن طريق إضافة أدوية إضافية موضعيا إلى الآبار أثناء التجربة ؛ ومع ذلك ، في الحالة الأخيرة ، يصعب تحديد جرعة التعرض الفعلية بعد إضافة دواء إضافي إلى بئر موجود بدقة وتعتمد على مدى سرعة تحلل الدواء. يعد كل من WorMotel و Worm Corral ممتازين لتصوير برايتفيلد أو دارك فيلد لالتقاط المعلومات المتعلقة بالنشاط وفسيولوجيا الحيوان (مثل النمو والتطور). في حين يمكن استخدام هذه الأنظمة لمراقبة التألق ، في تجربتنا ، فإن PDMS المستخدمة لإنشاء تقنيات التصوير الأخرى أحادية الدودة عرضة لتشكيل فقاعات دقيقة ، والتقاط الجسيمات ، وغيرها من التشوهات الصغيرة التي تولد القطع الأثرية الفلورية غير المنتظمة التي تتداخل مع التصور الفلوري المتسق والقياس الكمي ، خاصة في نطاق الانبعاثات ل GFP ، الفلوروفور الأكثر شيوعا المستخدم في أبحاث C. elegans. حتى الآن ، يعتمد التصوير الفلوري الحي للحيوانات الفردية C. elegans بطريقة طولية بشكل أساسي على أجهزة الموائع الدقيقة17.
هنا ، نصف طريقة جديدة لزراعة C. elegans الفردية على وسائط صلبة متوافقة مع كل من التدخلات المكروهة والتصوير الفلوري المباشر. يشبه هذا النهج في المفهوم تقنيات التصوير الأخرى أحادية الدودة ، باستثناء أنه يتم استبدال شريحة PDMS المصبوبة خصيصا بصواني دقيقة من البوليسترين متاحة تجاريا تم تطويرها في الأصل لمقايسات السمية الخلوية الدقيقة (وتسمى أيضا صواني Terasaki)18. تتميز هذه الصواني الدقيقة بآبار يمكن ملؤها بالوسائط الصلبة وبذرها بالأغذية البكتيرية ، مما يحاكي عن كثب البيئة التي تعاني منها الحيوانات في ظل منهجية استزراع NGM الصلبة القياسية. كل بئر محاط بحاجز مكروه من حمض النخيل بدلا من كبريتات النحاس. يستخدم حمض البالمتيك بشكل شائع لمنع الديدان من الفرار من الوسائط الصلبة ، باستخدام ثقافة المجموعة القياسية على ألواح بتري في التجارب التي تواجه فيها الديدان بيئة مكروهة مثل القيود الغذائية أو التعرض لضغوط كيميائية. تنتج الصواني الدقيقة أيضا خلفية فلورية بسيطة ومتسقة ، مما يسمح بالتصوير الفلوري للحيوانات مباشرة في بيئة الاستزراع الخاصة بهم. لا يسمح نظام الاستزراع الجديد القائم على الأجار الصلب أحادي الحيوان بتتبع الحيوانات الفردية طوال الحياة ومراقبة النمو والتطور والنشاط والعمر فحسب ، بل إنه متوافق أيضا مع الفحص المجهري الفلوري المباشر. نظرا لأنه يمكن تصوير الديدان دون شلل أو تثبيت ، يمكن قياس المؤشرات الحيوية الفلورية في الجسم الحي طوليا في الحيوانات الفردية المتبقية على وسائط الاستزراع الخاصة بها ، مما يسمح بملاحظة التغيرات الديناميكية على مدى عمر كل. يتوافق نظام الثقافة هذا أيضا مع الأنظمة الآلية من الجيل الحالي لتتبع العمر الافتراضي والمقاييس الصحية الأخرى14,19. نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة C. elegans الفردية في هذا النظام القائم على microtray ، ومناقشة المزالق المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، ومناقشة المزايا والقيود المتعلقة بالأنظمة الأخرى ، وعلى وجه الخصوص ، بروتوكول WorMotel15 المحدث والمحسن.
تتكون كل بيئة استزراع دودة واحدة من صينية صغيرة مثبتة داخل صينية قياسية أحادية البئر باستخدام محول مخصص مطبوع 3D (الشكل 1A). تمتلئ الآبار بوسائط نمو نيماتودا الأغاروز منخفضة الذوبان (lmNGM) ، وتزرع بالبكتيريا المركزة كمصدر للغذاء ، وتحيط بها طبقة حمض النخيل لمنع الديدان من الفرار (الشكل 1 ب). تمتلئ المسافة بين microtray وجدران لوحة البئر الواحد ببلورات الماء المشبع للحفاظ على الرطوبة (الشكل 1B). يتم تطبيق طلاء منظف على غطاء الدرج لمنع التكثيف. تتم إضافة دودة واحدة إلى كل بئر ، ويتم إغلاق صينية البئر الواحدة باستخدام Parafilm للحفاظ على الرطوبة والسماح بتبادل الأكسجين. يمكن تحضير ما يصل إلى ستة صواني دقيقة بشكل معقول بالتوازي من قبل باحث واحد ممارس.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، نصف نظام ثقافة جديد يتكيف مع الصواني الدقيقة ، التي تم تطويرها في الأصل لمقايسات كتابة أنسجة مستضد كريات الدم البيضاء البشرية ، للسماح بعزل وتوصيف C. elegans المفردة بمرور الوقت في بيئة وسائط صلبة تشبه السياق NGM القائم على أجار وهو المعيار في أبحاث C. elegans. هذا النظام متوافق مع م?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل NIH R35GM133588 إلى G.L.S. ، ومنحة تدريب NIHT32GM008659 إلى L.E. ، وجائزة محفز الأكاديمية الوطنية الأمريكية للطب إلى G.L.S. ، وصندوق مبادرة التكنولوجيا والبحوث في ولاية أريزونا الذي يديره مجلس حكام أريزونا.
Materials
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
- Shaham, S. Methods in Cell Biology. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2006).
- Boulin, T., et al. Eight genes are required for functional reconstitution of the Caenorhabditis elegans levamisole-sensitive acetylcholine receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (47), 18590-18595 (2008).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress & Chaperones. 8 (1), 1-7 (2003).
- Xian, B., et al. WormFarm: a quantitative control and measurement device toward automated Caenorhabditis elegans aging analysis. Aging Cell. 12 (3), 398-409 (2013).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Clark, A. S., Huayta, J., Arulalan, K. S., San-Miguel, A. Microfluidic Devices for Imaging and Manipulation of C. elegans. Micro and Nano Systems for Biophysical Studies of Cells and Small Organisms. , 295-321 (2021).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Atakan, H. B., et al. Automated platform for long-term culture and high-content phenotyping of single C. elegans worms. Scientific Reports. 9 (1), 14340 (2019).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. (49), e2496 (2011).
- Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains. Journal of Visualized Experiments. (51), e2745 (2011).
- Laranjeiro, R., Harinath, G., Burke, D., Braeckman, B. P., Driscoll, M. Single swim sessions in C. elegans induce key features of mammalian exercise. BMC Biology. 15 (1), 30 (2017).
- Çelen, &. #. 3. 0. 4. ;., Doh, J. H., Sabanayagam, C. R. Effects of liquid cultivation on gene expression and phenotype of C. elegans. BMC Genomics. 19 (1), 562 (2018).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Turner, E., et al. Long-term culture and monitoring of isolated nematodes on solid media in WorMotels. Journal of Visualized Experiments. , (2022).
- Pittman, W. E., et al. A simple apparatus for individual C. elegans culture. Methods in Molecular Biology. 2144, 29-45 (2020).
- Breimann, L., Preusser, F., Preibisch, S. Light-microscopy methods in C. elegans research. Current Opinion in Systems Biology. 13, 82-92 (2019).
- Mittal, K. K., Mickey, M. R., Singal, D. P., Terasaki, P. I. Serotyping for homotransplantation. 18. Refinement of microdroplet lymphocyte cytotoxicity test. Transplantation. 6 (8), 913-927 (1968).
- . Worm paparazzi-a high throughput lifespan and healthspan analysis platform for individual Caenorhabditis elegans Available from: https://repository.arizona.edu/handle/10150/661628 (2021)
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Moore, B. T., Jordan, J. M., Baugh, L. R. WormSizer: high-throughput analysis of nematode size and shape. PloS One. 8 (2), 57142 (2013).
- Husson, S. J., Costa, W. S., Schmitt, C., Gottschalk, A. Keeping track of worm trackers. WormBook: The Online Review of C. Elegans Biology. , 1-17 (2013).
- Roussel, N., Sprenger, J., Tappan, S. J., Glaser, J. R. Robust tracking and quantification of C. elegans body shape and locomotion through coiling, entanglement, and omega bends. Worm. 3 (4), 982437 (2014).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451 (7178), 569-572 (2008).
- Peters, M. J., et al. The transcriptional landscape of age in human peripheral blood. Nature Communications. 6 (1), 8570 (2015).
- Sutphin, G. L., et al. Caenorhabditis elegans orthologs of human genes differentially expressed with age are enriched for determinants of longevity. Aging Cell. 16 (4), 672-682 (2017).
- Felker, D. P., Robbins, C. E., McCormick, M. A. Automation of C. elegans lifespan measurement. Translational Medicine of Aging. 4, 1-10 (2020).
