Culture à long terme de Caenorhabditis elegans individuelle sur milieu solide pour la surveillance longitudinale de la fluorescence et les interventions aversives

Summary

Ici, nous présentons un protocole de culture de nématodes individuels isolés sur des milieux solides pour le suivi des paramètres physiologiques tout au long de la vie et la quantification de la fluorescence. Ce système de culture comprend une barrière d’acide palmitique autour des puits à ver unique pour empêcher les animaux de fuir, ce qui permet l’utilisation d’interventions aversives, y compris des bactéries pathogènes et des facteurs de stress chimiques.

Abstract

Caenorhabditis elegans est largement utilisé pour étudier la biologie du vieillissement. La pratique courante dans les études sur le vieillissement de C. elegans consiste à cultiver des groupes de vers sur des milieux de croissance de nématodes solides (NGM), ce qui permet la collecte efficace de données au niveau de la population pour la survie et d’autres phénotypes physiologiques, et l’échantillonnage périodique des sous-populations pour la quantification des biomarqueurs fluorescents. Les limites de cette approche sont l’incapacité (1) de suivre les vers individuels au fil du temps pour développer des trajectoires d’âge pour les phénotypes d’intérêt et (2) de surveiller les biomarqueurs fluorescents directement dans le contexte de l’environnement de culture. Les approches de culture alternatives utilisent la culture liquide ou la microfluidique pour surveiller les animaux individuels au fil du temps, dans certains cas, y compris la quantification de la fluorescence, avec le compromis que l’environnement de culture est contextuellement distinct du NGM solide. Le WorMotel est un dispositif multipuits microfabriqué décrit précédemment pour la culture de vers isolés sur NGM solide. Chaque ver est maintenu dans un puits contenant des NGM solides entouré d’un fossé rempli de sulfate de cuivre, un répulsif de contact pour C. elegans, permettant une surveillance longitudinale des animaux individuels. Nous trouvons que le sulfate de cuivre est insuffisant pour empêcher les vers de fuir lorsqu’ils sont soumis à des interventions aversives courantes dans la recherche sur le vieillissement, y compris la restriction alimentaire, les bactéries pathogènes et les agents chimiques qui induisent un stress cellulaire. Les dispositifs multipuits sont également moulés à partir de polydiméthylsiloxane, qui produit des artefacts de fond élevés en imagerie par fluorescence. Ce protocole décrit une nouvelle approche pour la culture de vers ronds isolés sur NGM solide à l’aide de microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce, conçus à l’origine pour le typage de l’antigène leucocytaire humain (HLA), permettant de mesurer la survie, les phénotypes physiologiques et la fluorescence tout au long de la vie. Une barrière d’acide palmitique empêche les vers de fuir, même en présence de conditions aversives. Chaque plaque peut cultiver jusqu’à 96 animaux et s’adapte facilement à une variété de conditions, y compris les restrictions alimentaires, l’ARNi et les additifs chimiques, et est compatible avec les systèmes automatisés de collecte de données sur la durée de vie et l’activité.

Introduction

C. elegans est un puissant organisme modèle pour la recherche en génétique, en biologie cellulaire et en biologie moléculaire, car ils sont facilement cultivés en laboratoire, ont une durée de vie et une durée de vie courtes, partagent un degré élevé d’homologie protéique avec les mammifères et ont une structure corporelle transparente qui permet la visualisation in vivo des protéines fluorescentes et des colorants¹. En raison de l’utilisation de longue date de C. elegans comme système modèle majeur dans divers domaines, y compris la biologie du développement et le vieillissement, leur croissance et leur développement sont bien compris, leur génome a été entièrement séquencé et une foule d’outils génétiques puissants ont été créés, y compris des bibliothèques d’alimentation en ARNi à l’échelle du génome et des milliers de souches mutantes et transgéniques. Historiquement, C. elegans est cultivé en tant que population sur des milieux de croissance de nématodes gélose solides (NGM), et les phénotypes sont évalués manuellement soit par observation directe, soit par imagerie et analyse en aval. La microscopie fluorescente est utilisée pour capturer une variété de phénotypes moléculaires à l’aide de colorants ou de marqueurs fluorescents exprimés de manière transgénique chez des individus de C. elegans. L’imagerie fluorescente consiste généralement à fixer ou à paralyser un animal sur des lames contenant de minces pastilles d’agarose, ce qui est envahissant et souvent mortel. Elle implique également l’utilisation de produits chimiques, tels que le lévamisole ou l’azoture de sodium, qui peuvent potentiellement interférer avec le processus moléculaire d’intérêt ^2,3. Ensemble, ces approches permettent de recueillir des données transversales à l’échelle de la population sur un large éventail de phénotypes, mais ne permettent pas le suivi des animaux individuels au fil du temps.

Au cours des dernières années, plusieurs approches ont émergé pour cultiver C. elegans isolé, permettant aux chercheurs de capturer les changements dynamiques dans les phénotypes physiologiques et moléculaires des animaux au fil du temps en utilisant de nouvelles technologies d’imagerie. Une catégorie d’approche de culture de C. elegans est constituée de dispositifs microfluidiques, notamment WormFarm⁴, la puce Nemalife⁵ et la puce « comportementale » de Chronis et ^al.6, entre autres ^7,8,9. À cela s’ajoutent les méthodes de culture à base de liquide, qui utilisent des plaques multipuits pour caractériser des vers individuels ou de petites populations au fil du temps^10,11. La microfluidique et les systèmes de microplaques fournissent d’excellentes mesures quantitatives des réponses phénotypiques chez C. elegans jusqu’à un seul animal, mais l’environnement de culture présente une limite clé. La grande majorité des recherches antérieures sur C. elegans, en particulier dans le domaine du vieillissement, ont été réalisées sur des milieux solides à base d’agar-agar. La culture liquide fait nager C. elegans en continu et représente un contexte environnemental distinct qui peut modifier la biologie sous-jacente. Par exemple, les animaux cultivés dans des milieux liquides ont considérablement modifié la teneur en matières grasses et l’expression des gènes – en particulier pour les gènes impliqués dans la réponse au stress – par rapport aux animaux cultivés sur NGM solide à base d’agar^12,13. Une autre catégorie de méthodes d’imagerie sur un seul animal implique des dispositifs de polydiméthylsiloxane (PDMS) qui isolent des animaux individuels sur des milieux solides, dans le but d’imiter plus étroitement l’environnement standard rencontré par les vers cultivés sur NGM solide en culture de groupe sur plaques de Petri. Le WorMotel est un appareil PDMS de 240 puits conçu pour cultiver des animaux individuels sur des supports solides. Chaque puits est rempli d’un NGM modifié utilisant de l’agarose à faible fusion au lieu de gélose et ensemencé avec des aliments bactériens, créant un environnement de milieux solides similaire au système de culture le plus courant utilisant des plaques de Petri. Les parois du puits sont rondes, ce qui permet d’imager chaque animal quel que soit son emplacement dans le puits (en évitant l’obscurcissement visuel causé par un animal près d’un mur dans une plaque multipuits). Le sulfate de cuivre dans un fossé étroit entourant chaque puits est utilisé comme moyen de dissuasion pour garder les animaux dans leurs puits^14,15. Une limite de cette approche est que le sulfate de cuivre est inefficace pour empêcher les vers de fuir lorsque des conditions environnementales aversives sont présentes, y compris des restrictions alimentaires, des bactéries pathogènes ou des produits chimiques qui induisent un stress cellulaire (par exemple, le paraquat).

Un deuxième système qui utilise des milieux solides est le Worm Corral, qui utilise un hydrogel pour créer un petit environnement étanche pour chaque ver sur une lame, permettant une surveillance à long terme des animaux isolés individuellement¹⁶. Une limitation clé est que les animaux doivent être scellés dans l’environnement sous forme d’œufs, ce qui nécessite l’utilisation d’animaux stériles pour empêcher la reproduction et limite les traitements médicamenteux à une seule application. Les essais de médicaments multidoses peuvent être réalisés dans le WorMotel soit en effectuant plusieurs cycles d’exposition avant de transférer les vers dans l’appareil, soit en ajoutant localement des médicaments supplémentaires aux puits pendant l’expérience; Cependant, dans ce dernier cas, la dose réelle d’exposition après l’ajout d’un médicament supplémentaire à un puits existant est difficile à quantifier avec précision et dépend de la rapidité avec laquelle le médicament se dégrade. Le WorMotel et le Worm Corral sont excellents pour l’imagerie en fond clair ou en fond noir afin de capturer des informations liées à l’activité et à la physiologie animale (par exemple, la croissance et le développement). Bien que ces systèmes puissent être utilisés pour surveiller la fluorescence, selon notre expérience, le PDMS utilisé pour créer les autres technologies d’imagerie à ver unique est susceptible de former des microbulles, de capturer des particules et d’autres petites anomalies qui génèrent des artefacts fluorescents irréguliers qui interfèrent avec la visualisation et la quantification cohérentes de la fluorescence, en particulier dans la plage d’émission de GFP, le fluorophore le plus couramment utilisé dans la recherche sur C. elegans. À ce jour, l’imagerie par fluorescence vivante de C. elegans d’animaux individuels de manière longitudinale repose principalement sur des dispositifs microfluidiques¹⁷.

Ici, nous décrivons une nouvelle méthode de culture de C. elegans individuels sur des milieux solides qui est compatible à la fois avec les interventions aversives et l’imagerie fluorescente directe. Cette approche est similaire dans son concept à d’autres technologies d’imagerie à ver unique, sauf que la puce PDMS moulée sur mesure est remplacée par des microplateaux en polystyrène disponibles dans le commerce développés à l’origine pour les tests de microcytotoxicité (aussi communément appelés plateaux Terasaki)¹⁸. Ces microplateaux comportent des puits qui peuvent être remplis de milieux solides et ensemencés avec des aliments bactériens, imitant étroitement l’environnement vécu par les animaux selon la méthodologie standard de culture de NGM solide. Chaque puits est entouré d’une barrière aversive d’acide palmitique plutôt que de sulfate de cuivre. L’acide palmitique est couramment utilisé pour empêcher les vers de fuir les milieux solides, en utilisant une culture de groupe standard sur des plaques de Petri dans des expériences où les vers sont confrontés à un environnement aversif comme une restriction alimentaire ou une exposition à un facteur de stress chimique. Les microplateaux produisent également un fond fluorescent minimal et cohérent, permettant l’imagerie fluorescente des animaux directement dans leur environnement de culture. Ce nouveau système de culture à base de gélose solide à animal unique permet non seulement de suivre les animaux individuels tout au long de la vie et de surveiller la croissance, le développement, l’activité et la durée de vie, mais il est également compatible avec la microscopie fluorescente directe. Parce que les vers peuvent être imagés sans paralysie ni fixation, les biomarqueurs de fluorescence in vivo peuvent être quantifiés longitudinalement chez les animaux individuels restant sur leur milieu de culture, permettant l’observation des changements dynamiques au cours de la vie de chaque animal. Ce système de culture est également compatible avec les systèmes automatisés de la génération actuelle pour le suivi de la durée de vie et d’autres paramètres de santé^14,19. Nous fournissons un protocole détaillé pour la culture individuelle de C. elegans dans ce système à base de microplateau, discutons des pièges potentiels et du dépannage, et discutons des avantages et des limites par rapport aux autres systèmes, et en particulier, un protocole WorMotel mis à jour et optimisé¹⁵.

Chaque environnement de culture à vis sans fin unique se compose d’un microplateau monté à l’intérieur d’un plateau standard à puits unique à l’aide d’un adaptateur personnalisé imprimé en 3D (Figure 1A). Les puits sont remplis de milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM), ensemencés de bactéries concentrées comme source de nourriture et entourés d’un revêtement d’acide palmitique pour empêcher les vers de fuir (figure 1B). L’espace entre le microplateau et les parois de la plaque à puits unique est rempli de cristaux d’eau saturés pour maintenir l’humidité (Figure 1B). Un revêtement détergent est appliqué sur le couvercle du plateau pour éviter la condensation. Un seul ver est ajouté à chaque puits, et le plateau à puits unique est scellé avec du parafilm pour maintenir l’humidité et permettre l’échange d’oxygène. Jusqu’à six microplateaux peuvent raisonnablement être préparés en parallèle par un seul chercheur expérimenté.

Protocol

1. Recettes REMARQUE: Préparez les solutions mères avant de commencer la préparation de la plaque de microplateau. Solutions mères pour milieux de croissance de nématodes agarose à faible point de fusion (lmNGM)Préparer 1 M K2HPO4 en dissolvant 174,18 g deK2HPO4dans 1 L d’eau désionisée stérile dans un flacon de 1 L. Autoclaver la solution à 121 °C, 15 psi, pendant 30 min et la conserver à température ambiante …

Representative Results

L’environnement de culture de vers uniques à base de microplateaux décrit ici peut être utilisé pour surveiller une variété de phénotypes, y compris la durée de vie et la durée de santé, l’activité et le mouvement, la forme du corps et la géométrie rampante, et l’expression de biomarqueurs fluorescents exprimés transgéniquement chez des animaux individuels au fil du temps. Le système de culture de microplateaux est compatible avec l’analyse de la durée de vie par notation manuelle ou collecte d?…

Discussion

Ici, nous décrivons un nouveau système de culture qui adapte les microplateaux, développé à l’origine pour les tests de typage tissulaire de l’antigène leucocytaire humain, afin de permettre l’isolement et la caractérisation de C. elegans uniques au fil du temps dans un environnement de milieux solides qui est contextuellement similaire au NGM à base d’agar qui est la norme dans la recherche sur C. elegans. Ce système est compatible avec une variété d’interventions, y compris la re…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP