縦断的蛍光モニタリングと嫌悪的介入のための固体培地上での個々の カエノラブディティスエレガンスの 長期培養
Summary
ここでは、生涯にわたる生理学的パラメータの追跡と蛍光定量のために、単離された個々の線虫を固体培地上で培養するためのプロトコルを紹介します。この培養システムには、動物が逃げるのを防ぐために、シングルワームウェルの周りにパルミチン酸バリアが含まれており、病原菌や化学的ストレッサーなどの嫌悪的介入を使用できます。
Abstract
カエノラブディティスエレガンスは 、老化生物学の研究に広く使用されています。 C. elegans 老化研究の標準的な方法は、固体線虫増殖培地(NGM)上で線虫のグループを培養し、生存およびその他の生理学的表現型に関する集団レベルのデータの効率的な収集を可能にし、蛍光バイオマーカー定量のための亜集団の定期的なサンプリングを可能にします。このアプローチの限界は、(1)個々の線虫を経時的に追跡して、関心のある表現型の年齢軌跡を開発することができないこと、および(2)培養環境のコンテキストで蛍光バイオマーカーを直接監視できないことです。代替培養アプローチでは、液体培養またはマイクロフルイディクスを使用して、個々の動物を経時的にモニタリングし、場合によっては蛍光定量を含め、培養環境が固体NGMとは文脈的に異なるというトレードオフがあります。WorMotelは、固体NGM上で単離されたワームを培養するための前述の微細加工マルチウェルデバイスです。各ワームは、 C. elegansの接触忌避剤である硫酸銅で満たされた堀に囲まれた固体NGMを含むウェルに維持され、個々の動物の縦方向のモニタリングを可能にします。硫酸銅は、食事制限、病原菌、細胞ストレスを誘発する化学物質など、老化研究で一般的な嫌悪的な介入を受けた場合、ワームの逃げを防ぐには不十分であることがわかりました。マルチウェルデバイスもポリジメチルシロキサンから成形されているため、蛍光イメージングで高いバックグラウンドアーチファクトが発生します。このプロトコルは、もともとヒト白血球抗原(HLA)タイピング用に設計された市販のポリスチレンマイクロトレイを使用して、固形NGM上で単離された回虫を培養するための新しいアプローチを説明し、寿命全体にわたる生存、生理学的表現型、および蛍光の測定を可能にします。パルミチン酸バリアは、嫌悪条件が存在する場合でも、ワームが逃げるのを防ぎます。各プレートは最大96匹の動物を培養でき、食事制限、RNAi、化学添加物などのさまざまな条件に簡単に適応でき、寿命と活動データを収集するための自動システムと互換性があります。
Introduction
C. elegansは、実験室での培養が容易で、世代時間と寿命が短く、哺乳類と高度なタンパク質相同性を共有し、蛍光タンパク質や色素のin vivo可視化を可能にする透明な体構造を持っているため、遺伝学、細胞生物学、分子生物学の研究のための強力なモデル生物です1。発生生物学や老化を含むさまざまな分野で主要なモデルシステムとしてC.エレガンスが長年使用されてきた結果、その成長と発達はよく理解され、ゲノムは完全に配列決定され、ゲノムワイドRNAiフィードライブラリや数千の変異株やトランスジェニック株など、多くの強力な遺伝ツールが作成されています。歴史的に、C.エレガンスは固体寒天線虫増殖培地(NGM)上の集団として培養され、表現型は直接観察またはイメージングとダウンストリーム分析のいずれかによって手動で評価されています。蛍光顕微鏡は、個々のC.エレガンスの色素または遺伝子組み換え発現蛍光タグを使用して、さまざまな分子表現型をキャプチャするために使用されます。蛍光イメージングは通常、薄いアガロースパッドを含むスライド上で動物を固定または麻痺させることを含み、これは侵襲的であり、しばしば致命的です。また、レバミゾールやアジ化ナトリウムなどの化学物質の使用も含まれており、目的の分子プロセスを妨害する可能性があります2,3。これらのアプローチを組み合わせることで、広範囲の表現型にわたって横断的な集団レベルのデータを収集できますが、個々の動物を経時的に追跡することはできません。
近年、単離されたC.エレガンスを培養するためのいくつかのアプローチが登場し、研究者は新しいイメージング技術を利用して動物の生理学的および分子表現型の動的な変化を経時的に捉えることができます。C.エレガンス培養アプローチの1つのカテゴリは、WormFarm4、Nemalifeチップ5、およびChronisらによる「挙動」チップ6を含むマイクロ流体デバイスであり、とりわけ様々なもの7,8,9である。これらに関連する液体ベースの培養法は、マルチウェルプレートを使用して個々のワームまたは小さな集団を経時的に特徴付けます10,11。マイクロフルイディクスとマイクロプレートシステムは、C.エレガンスから1匹までの表現型応答の優れた定量的測定を提供しますが、培養環境には重要な制限があります。 C. elegansの過去の研究の大部分は、特に老化の分野で、固体寒天ベースの培地で完了しています。液体培養は、C.エレガンスを連続的に泳がせ、基礎となる生物学を変える可能性のある明確な環境状況を表しています。例えば、液体培地で培養された動物は、寒天ベースの固体NGM12,13で培養された動物と比較して、脂肪含有量と遺伝子発現(特にストレス応答に関与する遺伝子)が大幅に変化しました。単一動物イメージング法の代替カテゴリには、ペトリプレート上のグループ培養で固体NGMで培養されたワームが経験する標準的な環境をより厳密に模倣するために、固体培地上で個々の動物を分離するポリジメチルシロキサン(PDMS)デバイスが含まれます。WorMotelは、固体培地上で個々の動物を培養するために設計された240ウェルPDMS装置です。各ウェルは、寒天の代わりに低融点アガロースを使用した修飾NGMで満たされ、バクテリアフードが播種され、ペトリプレートを使用した最も一般的な培養システムと同様の固体培地環境が作成されます。ウェルの壁は丸いため、ウェル内の場所に関係なく各動物を画像化できます(マルチウェルプレートの壁の近くに動物によって引き起こされる視覚的な不明瞭さを回避します)。各ウェルを囲む狭い堀の硫酸銅は、動物をウェルに留めておくための抑止力として使用されます14,15。このアプローチの限界は、硫酸銅は、食事制限、病原菌、または細胞ストレスを誘発する化学物質(パラコートなど)を含む嫌悪的な環境条件が存在する場合に、ワームが逃げるのを防ぐのに効果がないことです。
固体培地を使用する2番目のシステムは、ヒドロゲルを使用してスライド上の各ワームの小さな密閉環境を作成し、個別に分離された動物の長期モニタリングを可能にするWorm Corralです16。主な制限は、動物を卵として環境に密封する必要があり、繁殖を防ぐために無菌動物を使用する必要があり、薬物治療を単一の用途に制限することです。複数回投与の薬物試験は、ワームをデバイスに移す前に複数回の曝露を実施するか、実験中にウェルに局所的に薬物を追加することによって、WorMotelで達成できます。しかしながら、後者の場合、既存のウェルに追加の薬物を添加した後の実際の曝露量は正確に定量することは困難であり、そして薬物がどれだけ急速に分解するかに依存する。WorMotelとWorm Corralはどちらも、活動や動物の生理学(成長や発達など)に関連する情報をキャプチャするための明視野または暗視野イメージングに最適です。これらのシステムは蛍光のモニタリングに使用できますが、私たちの経験では、他のシングルワームイメージング技術の作成に使用されるPDMSは、マイクロバブルを形成したり、粒子を捕捉したり、不規則な蛍光アーチファクトを生成したりするその他の小さな異常が発生しやすく、特に C.elegans 研究で使用される最も一般的な蛍光色素であるGFPの発光範囲で、一貫した蛍光の視覚化と定量を妨げます。今日まで、縦方向の 様式でのC.エレガンス 個々の動物のライブ蛍光イメージングは、主にマイクロ流体デバイス17に依存している。
ここでは、嫌悪的介入と直接蛍光イメージングの両方に適合する固体培地上で個々のC.elegansを培養するための新しい方法について説明します。このアプローチは、カスタム成形されたPDMSチップが、マイクロ細胞毒性アッセイ用に開発された市販のポリスチレンマイクロトレイ(一般にテラサキトレイとも呼ばれる)に置き換えられることを除いて、他のシングルワームイメージング技術と概念が似ています18。これらのマイクロトレイは、固体培地を充填し、細菌性食品を播種できるウェルを備えており、標準的な固体NGM培養方法論の下で動物が経験する環境を厳密に模倣しています。各ウェルは、硫酸銅ではなくパルミチン酸の嫌悪バリアに囲まれています。パルミチン酸は、食事制限や化学的ストレッサーへの曝露などの嫌悪的な環境でワームが挑戦される実験で、ペトリプレート上の標準的なグループ培養を使用して、ワームが固体培地から逃げるのを防ぐために一般的に使用されます。また、マイクロトレイは最小限の一貫した蛍光バックグラウンドを生成し、培養環境で直接動物の蛍光イメージングを可能にします。この新しい単一動物の固体寒天ベースの培養システムは、生涯を通じて個々の動物を追跡し、成長、発達、活動、および寿命を監視できるだけでなく、直接蛍光顕微鏡法とも互換性があります。麻痺や固定なしに線虫を画像化できるため、培養液上に残っている個々の動物においてin vivo蛍光バイオマーカーを縦方向に定量することができ、各動物の生涯にわたる動的変化を観察することができます。この培養システムは、寿命およびその他の健康指標を追跡するための現世代の自動化システムとも互換性がある14,19。このマイクロトレイベースのシステムで個々のC.エレガンスを培養するための詳細なプロトコルを提供し、潜在的な落とし穴とトラブルシューティングについて説明し、他のシステム、特に更新および最適化されたWorMotelプロトコル15と比較した利点と制限について説明します。
各シングルワーム培養環境は、カスタム3Dプリントアダプターを使用して標準のシングルウェルトレイ内に取り付けられたマイクロトレイで構成されています(図1A)。ウェルは低融点アガロース線虫増殖培地(lmNGM)で満たされ、食物源として濃縮細菌が播種され、ワームが逃げるのを防ぐためにパルミチン酸コーティングで囲まれています(図1B)。マイクロトレイとシングルウェルプレートの壁の間のスペースは、湿度を維持するために飽和水結晶で満たされています(図1B)。結露を防ぐために、トレイの蓋には洗剤コーティングが施されています。各ウェルに1つのワームを追加し、1つのウェルトレイをパラフィルムで密封して水分を維持し、酸素交換を可能にします。最大6つのマイクロトレイは、1人の実践的な研究者によって合理的に並行して準備することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、もともとヒト白血球抗原組織タイピングアッセイ用に開発されたマイクロトレイを適応させ、C.エレガンス研究の標準である寒天ベースのNGMと文脈的に類似した固体培地環境で、単一のC.エレガンスの分離と特性評価を経時的に可能にする新しい培養システムについて説明します。このシステムは、食事制限、外因性薬物治療、化学的または環境的ストレッサーへの挑…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NIH R35GM133588からGLS、NIHT32GM008659トレーニング助成金、GLSへの米国医学アカデミー触媒賞、およびアリゾナ州理事会が管理するアリゾナ州技術研究イニシアチブ基金によってサポートされました。
Materials
| 3D-printed terasaki inserts | Custom printing company | Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL |
FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament |
| AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood | Fisher Scientific | 36-100-4376 | |
| Bacto peptone | Thermo Scientific | 211677 | |
| CaCl2 | Acros organics | 349615000 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | N2 | Wildtype strain |
| Carbenicillin | Goldbio | C-103-25 | |
| Cholesterol | ICN Biomedicals Inc | 101380 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | Standard labratory food for C. elegans |
| Ethanol | Millipore | ex0276-4 | |
| Fisher Vortex Genie 2 | Fisher Scientific | G-560 | |
| FUdR | Research Products International | F10705-1.0 | |
| Hydrating water crystals | M2 Polymer Technologies | Type S | Type S super absorbent polymer |
| Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | GoldBio | I2481C100 | |
| K2HPO4 | Fisher Chemical | P288-500 | |
| Kimwipes | KimTech | 34155 | Task wipes |
| LB Broth, Lennox | BD Difco | 240230 | |
| Leica K5 sCMOS monochrome camera | Leica Microsystems | 11547112 | |
| Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope | Leica Microsystems | 10450826 | |
| Low-melt agarose | Research Products International | A20070-250.0 | |
| MgSO4 | Fisher Chemical | M-8900 | |
| NaCl | Fisher bioreagents | BP358-1 | |
| Nunc OmniTray Single-Well Plate | Thermo Scientific | 264728 | |
| Nystatin | Sigma | N1538 | |
| Palmitic acid | Acros organics | 129700010 | |
| Paper towels | Coastwide Professional | 365374 | |
| Parafilm M | Parafilm | 16-101 | |
| Stratagene UV Stratalinker 2400 | Stratagene | 400075 | UV crosslinker |
| Terasaki trays (Lambda) | One Lambda | 151431 | |
| Thermolyne Dri-bath | Thermolyne | DB28125 | |
| Tween | Thermo Scientific | J20605-AP |
References
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