Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Summary

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos para el seguimiento de parámetros fisiológicos de por vida y la cuantificación de fluorescencia. Este sistema de cultivo incluye una barrera de ácido palmítico alrededor de pozos de un solo gusano para evitar que los animales huyan, lo que permite el uso de intervenciones aversivas, incluidas bacterias patógenas y estresores químicos.

Abstract

Caenorhabditis elegans son ampliamente utilizados para estudiar la biología del envejecimiento. La práctica estándar en los estudios de envejecimiento de C. elegans es cultivar grupos de gusanos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM), lo que permite la recopilación eficiente de datos a nivel poblacional para la supervivencia y otros fenotipos fisiológicos, y el muestreo periódico de subpoblaciones para la cuantificación de biomarcadores fluorescentes. Las limitaciones de este enfoque son la incapacidad de (1) seguir gusanos individuales a lo largo del tiempo para desarrollar trayectorias de edad para fenotipos de interés y (2) monitorear biomarcadores fluorescentes directamente en el contexto del entorno de cultivo. Los enfoques de cultivo alternativos utilizan cultivo líquido o microfluídica para monitorear animales individuales a lo largo del tiempo, en algunos casos incluida la cuantificación de fluorescencia, con la desventaja de que el entorno de cultivo es contextualmente distinto del NGM sólido. El WorMotel es un dispositivo microfabricado de múltiples pozos previamente descrito para cultivar gusanos aislados en NGM sólido. Cada gusano se mantiene en un pozo que contiene NGM sólido rodeado por un foso lleno de sulfato de cobre, un repelente de contacto para C. elegans, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales individuales. Encontramos que el sulfato de cobre es insuficiente para evitar que los gusanos huyan cuando se someten a intervenciones aversivas comunes en la investigación del envejecimiento, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas y los agentes químicos que inducen estrés celular. Los dispositivos de múltiples pocillos también se moldean a partir de polidimetilsiloxano, que produce artefactos de alto fondo en imágenes de fluorescencia. Este protocolo describe un nuevo enfoque para cultivar gusanos redondos aislados en NGM sólido utilizando microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente, originalmente diseñadas para la tipificación de antígenos leucocitarios humanos (HLA), que permiten la medición de la supervivencia, los fenotipos fisiológicos y la fluorescencia a lo largo de la vida. Una barrera de ácido palmítico evita que los gusanos huyan, incluso en presencia de condiciones aversivas. Cada placa puede cultivar hasta 96 animales y se adapta fácilmente a una variedad de condiciones, incluyendo restricciones dietéticas, ARNi y aditivos químicos, y es compatible con sistemas automatizados para recopilar datos de vida útil y actividad.

Introduction

Los C. elegans son un poderoso organismo modelo para la investigación en genética, biología celular y biología molecular, porque se cultivan fácilmente en el laboratorio, tienen un tiempo de generación y vida útil cortos, comparten un alto grado de homología de proteínas con los mamíferos y tienen una estructura corporal transparente que permite la visualización in vivo de proteínas fluorescentes y colorantes¹. Como resultado del uso de larga data de C. elegans como un sistema modelo importante en una variedad de campos, incluida la biología del desarrollo y el envejecimiento, su crecimiento y desarrollo son bien conocidos, su genoma ha sido completamente secuenciado y se han creado una gran cantidad de poderosas herramientas genéticas, incluidas bibliotecas de alimentación de ARNi de todo el genoma y miles de cepas mutantes y transgénicas. Históricamente, C. elegans se cultiva como poblaciones en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM), y los fenotipos se evalúan manualmente mediante observación directa o mediante imágenes y análisis aguas abajo. La microscopía fluorescente se utiliza para capturar una variedad de fenotipos moleculares utilizando colorantes o etiquetas fluorescentes expresadas transgénicamente en C. elegans individuales. Las imágenes fluorescentes generalmente implican arreglar o paralizar a un animal en portaobjetos que contienen almohadillas delgadas de agarosa, lo cual es invasivo y a menudo letal. También implica el uso de productos químicos, como levamisol o azida de sodio, que potencialmente pueden interferir con el proceso molecular de interés ^2,3. Juntos, estos enfoques permiten recopilar datos transversales a nivel de población en una amplia gama de fenotipos, pero no permiten el seguimiento de animales individuales a lo largo del tiempo.

En los últimos años, han surgido varios enfoques para cultivar C. elegans aislados, lo que permite a los investigadores capturar cambios dinámicos en fenotipos fisiológicos y moleculares de animales a lo largo del tiempo utilizando nuevas tecnologías de imagen. Una categoría del enfoque de cultivo de C. elegans son los dispositivos microfluídicos, incluyendo WormFarm⁴, el chip Nemalife⁵ y el chip de “comportamiento” de Chronis et ^al.6, entre varios otros ^7,8,9. Relacionados con estos están los métodos de cultivo a base de líquidos, que utilizan placas de múltiples pocillos para caracterizar gusanos individuales o pequeñas poblaciones a lo largo del tiempo^10,11. Los sistemas de microfluídica y microplacas proporcionan excelentes mediciones cuantitativas de las respuestas fenotípicas en C. elegans hasta un solo animal, pero el entorno de cultivo presenta una limitación clave. La gran mayoría de las investigaciones anteriores en C. elegans, particularmente en el campo del envejecimiento, se han completado en medios sólidos basados en agar. El cultivo líquido hace que C. elegans nade continuamente y representa un contexto ambiental distinto que puede alterar la biología subyacente. Por ejemplo, los animales cultivados en medios líquidos han alterado drásticamente el contenido de grasa y la expresión génica, particularmente para los genes involucrados en la respuesta al estrés, en relación con los animales cultivados en NGM sólido a base de agar^12,13. Una categoría alternativa de métodos de imagen de un solo animal involucra dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que aíslan animales individuales en medios sólidos, en un esfuerzo por imitar más de cerca el entorno estándar experimentado por los gusanos cultivados en NGM sólido en cultivo grupal en placas de Petri. El WorMotel es un dispositivo PDMS de 240 pocillos diseñado para cultivar animales individuales en medios sólidos. Cada pocillo se llena con un NGM modificado utilizando agarosa de bajo punto de fusión en lugar de agar y se siembra con alimentos bacterianos, creando un entorno de medios sólidos similar al sistema de cultivo más común que utiliza placas de Petri. Las paredes del pozo son redondas, lo que permite obtener imágenes de cada animal independientemente de la ubicación en el pozo (evitando el oscurecimiento visual causado por un animal cerca de una pared en una placa de varios pocillos). El sulfato de cobre en un foso estrecho que rodea cada pozo se utiliza como elemento disuasorio para mantener a los animales en sus pozos^14,15. Una limitación de este enfoque es que el sulfato de cobre es ineficaz para evitar que los gusanos huyan cuando existen condiciones ambientales aversivas, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas o los productos químicos que inducen estrés celular (por ejemplo, paraquat).

Un segundo sistema que utiliza medios sólidos es el Worm Corral, que emplea un hidrogel para crear un pequeño ambiente sellado para cada gusano en un portaobjetos, lo que permite el monitoreo a largo plazo de animales aislados individualmente¹⁶. Una limitación clave es que los animales deben ser sellados en el medio ambiente como huevos, lo que requiere el uso de animales estériles para evitar la reproducción y limitar los tratamientos farmacológicos a una sola aplicación. Los ensayos de medicamentos de dosis múltiples se pueden lograr en el WorMotel ya sea realizando múltiples rondas de exposición antes de transferir gusanos al dispositivo o agregando tópicamente medicamentos adicionales a los pozos durante el experimento; Sin embargo, en este último caso, la dosis de exposición real después de agregar un medicamento adicional a un pozo existente es difícil de cuantificar con precisión y depende de la rapidez con que se degrada el medicamento. Tanto el WorMotel como el Worm Corral son excelentes para obtener imágenes de campo claro u oscuro para capturar información relacionada con la actividad y la fisiología animal (por ejemplo, crecimiento y desarrollo). Si bien estos sistemas se pueden usar para monitorear la fluorescencia, en nuestra experiencia, el PDMS utilizado para crear las otras tecnologías de imágenes de un solo gusano es propenso a formar microburbujas, capturar partículas y otras pequeñas anomalías que generan artefactos fluorescentes irregulares que interfieren con la visualización y cuantificación de fluorescencia consistente, especialmente en el rango de emisión de GFP, el fluoróforo más común utilizado en la investigación de C. elegans. Hasta la fecha, las imágenes de fluorescencia en vivo de animales individuales de C. elegans de manera longitudinal se basan principalmente en dispositivos microfluídicos¹⁷.

Aquí, describimos un método novedoso para cultivar C. elegans individuales en medios sólidos que es compatible tanto con intervenciones aversivas como con imágenes fluorescentes directas. Este enfoque es similar en concepto a otras tecnologías de imágenes de un solo gusano, excepto que el chip PDMS moldeado a medida se reemplaza con microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente desarrolladas originalmente para ensayos de microcitotoxicidad (también comúnmente llamadas bandejas Terasaki)¹⁸. Estas microbandejas cuentan con pozos que pueden llenarse con medios sólidos y sembrarse con alimentos bacterianos, imitando de cerca el entorno experimentado por los animales bajo la metodología estándar de cultivo NGM sólido. Cada pocillo está rodeado por una barrera aversiva de ácido palmítico en lugar de sulfato de cobre. El ácido palmítico se usa comúnmente para evitar que los gusanos huyan de los medios sólidos, utilizando el cultivo grupal estándar en placas de Petri en experimentos donde los gusanos son desafiados con un ambiente aversivo como la restricción dietética o la exposición a un factor estresante químico. Las microbandejas también producen un fondo fluorescente mínimo y consistente, lo que permite obtener imágenes fluorescentes de animales directamente en su entorno de cultivo. Este nuevo sistema de cultivo basado en agar sólido de un solo animal no solo permite rastrear animales individuales a lo largo de la vida y monitorear el crecimiento, el desarrollo, la actividad y la vida útil, sino que también es compatible con la microscopía fluorescente directa. Debido a que los gusanos se pueden visualizar sin parálisis ni fijación, los biomarcadores de fluorescencia in vivo se pueden cuantificar longitudinalmente en animales individuales que permanecen en sus medios de cultivo, lo que permite la observación de cambios dinámicos a lo largo de la vida de cada animal. Este sistema de cultivo también es compatible con los sistemas automatizados de la generación actual para el seguimiento de la vida útil y otras métricas de salud^14,19. Proporcionamos un protocolo detallado para cultivar C. elegans individuales en este sistema basado en microbandejas, discutimos posibles dificultades y solución de problemas, y discutimos las ventajas y limitaciones en relación con otros sistemas, y en particular, un protocolo WorMotel actualizado y optimizado¹⁵.

Cada entorno de cultivo de un solo gusano consiste en una microbandeja montada dentro de una bandeja estándar de un solo pozo utilizando un adaptador personalizado impreso en 3D (Figura 1A). Los pozos están llenos de medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM), sembrados con bacterias concentradas como fuente de alimento, y rodeados por una capa de ácido palmítico para evitar que los gusanos huyan (Figura 1B). El espacio entre la microbandeja y las paredes de la placa de un solo pozo se llena con cristales de agua saturada para mantener la humedad (Figura 1B). Se aplica un recubrimiento detergente a la tapa de la bandeja para evitar la condensación. Se agrega un solo gusano a cada pocillo, y la bandeja de un solo pozo se sella con Parafilm para mantener la humedad y permitir el intercambio de oxígeno. Hasta seis microbandejas pueden ser razonablemente preparadas en paralelo por un solo investigador experimentado.

Protocol

1. Recetas NOTA: Prepare soluciones madre antes de comenzar la preparación de la placa de microbandeja. Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM)Preparar 1 M K 2 HPO4 disolviendo 174,18 g de K2HPO4 en 1 Lde agua desionizada estéril en una botella de 1 L. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psi, durante 30 min y almacénela a temperatura ambiente (RT). Pre…

Representative Results

El entorno de cultivo de gusanos individuales basado en microbandejas descrito aquí se puede usar para monitorear una variedad de fenotipos, incluida la vida útil y la duración de la salud, la actividad y el movimiento, la forma del cuerpo y la geometría de rastreo, y la expresión de biomarcadores fluorescentes expresados transgénicamente en animales individuales a lo largo del tiempo. El sistema de cultivo de microbandejas es compatible con el análisis de vida útil a través de la puntuación manual o la recopil…

Discussion

Aquí, describimos un nuevo sistema de cultivo que adapta microbandejas, originalmente desarrollado para ensayos de tipificación de tejido de antígeno leucocitario humano, para permitir el aislamiento y caracterización de C. elegans individuales a lo largo del tiempo en un entorno de medios sólidos que es contextualmente similar al NGM basado en agar que es el estándar en la investigación de C. elegans. Este sistema es compatible con una variedad de intervenciones, incluida la restricción dieté…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP