Langzeitkultur einzelner Caenorhabditis elegans auf festen Medien für longitudinales Fluoreszenzmonitoring und aversive Interventionen

Summary

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, um isolierte einzelne Nematoden auf festen Medien zu kultivieren, um eine lebenslange Verfolgung physiologischer Parameter und eine Fluoreszenzquantifizierung zu ermöglichen. Dieses Kultursystem umfasst eine Palmitinsäurebarriere um einzelne Wurmbrunnen, um die Flucht der Tiere zu verhindern, was den Einsatz aversiver Interventionen, einschließlich pathogener Bakterien und chemischer Stressoren, ermöglicht.

Abstract

Caenorhabditis elegans wird häufig zur Erforschung der Biologie des Alterns verwendet. Die Standardpraxis in Studien zum Altern von C. elegans besteht darin, Gruppen von Würmern auf soliden Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) zu kultivieren, was die effiziente Erfassung von Daten auf Populationsebene für das Überleben und andere physiologische Phänotypen sowie die regelmäßige Probenahme von Subpopulationen zur Quantifizierung fluoreszierender Biomarker ermöglicht. Einschränkungen dieses Ansatzes sind die Unfähigkeit, (1) einzelne Würmer über die Zeit zu verfolgen, um Altersverläufe für Phänotypen von Interesse zu entwickeln, und (2) fluoreszierende Biomarker direkt im Kontext der Kulturumgebung zu überwachen. Alternative Kulturansätze verwenden Flüssigkultur oder Mikrofluidik, um einzelne Tiere im Laufe der Zeit zu überwachen, in einigen Fällen einschließlich Fluoreszenzquantifizierung, mit dem Kompromiss, dass sich die Kulturumgebung kontextuell von festem NGM unterscheidet. Das WorMotel ist ein zuvor beschriebenes mikrofabriziertes Multi-Well-Gerät zur Kultivierung isolierter Würmer auf festem NGM. Jeder Wurm wird in einem Brunnen mit festem NGM gehalten, der von einem mit Kupfersulfat gefüllten Graben umgeben ist, einem Kontaktschutzmittel für C. elegans, das eine longitudinale Überwachung der einzelnen Tiere ermöglicht. Wir stellen fest, dass Kupfersulfat nicht ausreicht, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn sie aversiven Eingriffen ausgesetzt sind, die in der Alternsforschung üblich sind, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogenen Bakterien und chemischen Wirkstoffen, die zellulären Stress induzieren. Die Multi-Well-Geräte sind ebenfalls aus Polydimethylsiloxan geformt, das bei der Fluoreszenzbildgebung hohe Hintergrundartefakte erzeugt. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen Ansatz für die Kultivierung isolierter Fadenwürmer auf festem NGM unter Verwendung kommerziell erhältlicher Polystyrol-Mikroschalen, die ursprünglich für die Typisierung des humanen Leukozytenantigens (HLA) entwickelt wurden und die Messung des Überlebens, der physiologischen Phänotypen und der Fluoreszenz über die gesamte Lebensspanne ermöglichen. Eine Palmitinsäurebarriere verhindert die Flucht von Würmern, auch bei aversiven Bedingungen. Jede Platte kann bis zu 96 Tiere kultivieren und passt sich leicht an eine Vielzahl von Bedingungen an, einschließlich diätetischer Restriktionen, RNAi und chemischer Zusätze, und ist mit automatisierten Systemen zur Erfassung von Lebensdauer- und Aktivitätsdaten kompatibel.

Introduction

C. elegans sind ein leistungsfähiger Modellorganismus für die Forschung in Genetik, Zellbiologie und Molekularbiologie, da sie leicht im Labor kultiviert werden können, eine kurze Generationszeit und Lebensdauer haben, ein hohes Maß an Proteinhomologie mit Säugetieren teilen und eine transparente Körperstruktur aufweisen, die die In-vivo-Visualisierung von fluoreszierenden Proteinen und Farbstoffen ermöglicht¹. Als Ergebnis der langjährigen Verwendung von C. elegans als wichtiges Modellsystem in einer Reihe von Bereichen, einschließlich der Entwicklungsbiologie und des Alterns, sind ihr Wachstum und ihre Entwicklung gut verstanden, ihr Genom wurde vollständig sequenziert und eine Vielzahl leistungsfähiger genetischer Werkzeuge wurde entwickelt, darunter genomweite RNAi-Fütterungsbibliotheken und Tausende von mutierten und transgenen Stämmen. Historisch gesehen werden C. elegans als Populationen auf soliden Agar-Nematoden-Wachstumsmedien (NGM) kultiviert, und Phänotypen werden manuell entweder durch direkte Beobachtung oder durch Bildgebung und nachgelagerte Analyse bewertet. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um eine Vielzahl von molekularen Phänotypen mit Farbstoffen oder transgen exprimierten Fluoreszenzmarkierungen in einzelnen C. elegans zu erfassen.Bei der Fluoreszenzbildgebung wird in der Regel ein Tier auf Objektträgern mit dünnen Agarosepolstern fixiert oder gelähmt, was invasiv und oft tödlich ist. Es beinhaltet auch den Einsatz von Chemikalien wie Levamisol oder Natriumazid, die möglicherweise in den interessierenden molekularen Prozess eingreifen können ^2,3. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die Erhebung von Querschnittsdaten auf Populationsebene über ein breites Spektrum von Phänotypen, erlauben jedoch nicht die Verfolgung einzelner Tiere im Laufe der Zeit.

In den letzten Jahren haben sich mehrere Ansätze zur Kultivierung isolierter C. elegans herausgebildet, die es Forschern ermöglichen, dynamische Veränderungen der physiologischen und molekularen Phänotypen von Tieren im Laufe der Zeit mithilfe neuer Bildgebungstechnologien zu erfassen. Eine Kategorie des Ansatzes der C. elegans-Kultur sind mikrofluidische Geräte, darunter WormFarm⁴, der Nemalife-Chip⁵ und der “Verhaltens”-Chip von Chronis et ^al.6, neben verschiedenen anderen ^7,8,9. Verwandt damit sind flüssige Kulturmethoden, die Multi-Well-Platten verwenden, um einzelne Würmer oder kleine Populationen über die Zeit zu charakterisieren^10,11. Mikrofluidik und Mikrotiterplattensysteme liefern hervorragende quantitative Messungen der phänotypischen Reaktionen in C. elegans bis hinunter zu einem einzelnen Tier, aber die Kulturumgebung stellt eine wesentliche Einschränkung dar. Die überwiegende Mehrheit der bisherigen Forschungen zu C. elegans, insbesondere auf dem Gebiet des Alterns, wurde auf festen Agar-basierten Medien durchgeführt. Die Flüssigkultur führt dazu, dass C. elegans kontinuierlich schwimmt und stellt einen bestimmten Umweltkontext dar, der die zugrunde liegende Biologie verändern kann. Zum Beispiel haben Tiere, die in flüssigen Medien kultiviert wurden, einen drastisch veränderten Fettgehalt und eine drastische Genexpression – insbesondere für Gene, die an der Stressantwort beteiligt sind – im Vergleich zu Tieren, die auf agarbasiertem festem NGM^12,13 kultiviert wurden. Eine alternative Kategorie von Einzeltier-Bildgebungsverfahren sind Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte, die einzelne Tiere auf festen Medien isolieren, um die Standardumgebung von Würmern, die auf festem NGM kultiviert wurden, in Gruppenkultur auf Petriplatten besser nachzuahmen. Das WorMotel ist ein 240-Well-PDMS-Gerät, das für die Kultivierung einzelner Tiere auf festen Medien entwickelt wurde. Jede Vertiefung wird mit einem modifizierten NGM gefüllt, bei dem anstelle von Agar niedrigschmelzende Agarose verwendet wird, und mit bakterieller Nahrung besiedelt, wodurch eine feste Medienumgebung entsteht, die dem gängigsten Kultursystem mit Petriplatten ähnelt. Die Wände des Brunnens sind rund, so dass jedes Tier unabhängig von seinem Standort im Brunnen abgebildet werden kann (wodurch die visuelle Verschleierung durch ein Tier in der Nähe einer Wand in einer Multiwell-Platte vermieden wird). Kupfersulfat in einem schmalen Graben, der jeden Brunnen umgibt, wird als Abschreckungsmittel verwendet, um Tiere in ihren Brunnen zu halten^14,15. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass das Kupfersulfat unwirksam ist, um Würmer an der Flucht zu hindern, wenn aversive Umweltbedingungen vorliegen, einschließlich Ernährungseinschränkungen, pathogener Bakterien oder Chemikalien, die zellulären Stress induzieren (z. B. Paraquat).

Ein zweites System, das feste Medien verwendet, ist der Worm Corral, bei dem ein Hydrogel verwendet wird, um für jeden Wurm auf einem Objektträger eine kleine versiegelte Umgebung zu schaffen, die eine Langzeitüberwachung einzelner isolierter Tiere ermöglicht¹⁶. Eine wesentliche Einschränkung besteht darin, dass Tiere als Eier in der Umwelt versiegelt werden müssen, was die Verwendung steriler Tiere erfordert, um die Fortpflanzung zu verhindern, und die medikamentöse Behandlung auf eine einzige Anwendung beschränkt. Mehrdosis-Arzneimittelstudien können im WorMotel durchgeführt werden, indem entweder mehrere Expositionsrunden durchgeführt werden, bevor die Würmer auf das Gerät übertragen werden, oder indem während des Experiments zusätzliche Medikamente topisch in die Vertiefungen gegeben werden. Im letzteren Fall ist die tatsächliche Expositionsdosis nach Zugabe eines zusätzlichen Medikaments zu einer bestehenden Bohrung jedoch schwer genau zu quantifizieren und hängt davon ab, wie schnell das Medikament abgebaut wird. Sowohl das WorMotel als auch der Worm Corral eignen sich hervorragend für Hellfeld- oder Dunkelfeldaufnahmen, um Informationen über Aktivität und Tierphysiologie (z. B. Wachstum und Entwicklung) zu erfassen. Während diese Systeme zur Überwachung der Fluoreszenz verwendet werden können, ist das PDMS, das zur Herstellung der anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien verwendet wird, unserer Erfahrung nach anfällig für die Bildung von Mikrobläschen, das Einfangen von Partikeln und andere kleine Anomalien, die unregelmäßige Fluoreszenzartefakte erzeugen, die eine konsistente Fluoreszenzvisualisierung und -quantifizierung beeinträchtigen, insbesondere im Emissionsbereich für GFP, den am häufigsten in der C. elegans-Forschung verwendeten Fluorophor. Bisher stützt sich die Live-Fluoreszenzbildgebung von C. elegans-Individuen im Längsschnitt hauptsächlich auf mikrofluidische Geräte¹⁷.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine neuartige Methode zur Kultivierung einzelner C. elegans auf festen Medien, die sowohl mit aversiven Interventionen als auch mit direkter Fluoreszenzbildgebung kompatibel ist. Dieser Ansatz ähnelt vom Konzept her anderen Einzelwurm-Bildgebungstechnologien, mit der Ausnahme, dass der kundenspezifisch geformte PDMS-Chip durch kommerziell erhältliche Polystyrol-Mikroschalen ersetzt wird, die ursprünglich für Mikrozytotoxizitätsassays entwickelt wurden (auch allgemein als Terasaki-Schalen bezeichnet)¹⁸. Diese Mikroschalen verfügen über Vertiefungen, die mit festem Medium gefüllt und mit bakteriellem Futter besiedelt werden können, wodurch die Umgebung, die Tiere mit der Standardmethode der festen NGM-Kultur erleben, genau nachgeahmt wird. Jede Vertiefung ist von einer aversiven Barriere aus Palmitinsäure anstelle von Kupfersulfat umgeben. Palmitinsäure wird häufig verwendet, um Würmer daran zu hindern, aus festen Medien zu fliehen, wobei Standardgruppenkulturen auf Petriplatten in Experimenten verwendet werden, in denen Würmer mit einer aversiven Umgebung wie Ernährungseinschränkungen oder der Exposition gegenüber einem chemischen Stressor konfrontiert werden. Die Mikroschalen erzeugen auch einen minimalen und konsistenten fluoreszierenden Hintergrund, was eine fluoreszierende Bildgebung von Tieren direkt in ihrer Kulturumgebung ermöglicht. Dieses neue Kultursystem auf Basis von festem Agar ermöglicht nicht nur die lebenslange Verfolgung einzelner Tiere und die Überwachung von Wachstum, Entwicklung, Aktivität und Lebensdauer, sondern ist auch mit der direkten Fluoreszenzmikroskopie kompatibel. Da die Würmer ohne Lähmung oder Fixierung abgebildet werden können, können In-vivo-Fluoreszenz-Biomarker in einzelnen Tieren, die auf ihren Nährmedien verbleiben, longitudinal quantifiziert werden, was die Beobachtung dynamischer Veränderungen über die Lebenszeit jedes Tieres ermöglicht. Dieses Kultursystem ist auch mit automatisierten Systemen der aktuellen Generation kompatibel, um die Lebensdauer und andere Gesundheitsmetriken zu verfolgen^14,19. Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Kultivierung einzelner C. elegans in diesem Microtray-basierten System zur Verfügung, diskutieren mögliche Fallstricke und Fehlerbehebungen und diskutieren die Vorteile und Einschränkungen im Vergleich zu anderen Systemen und insbesondere ein aktualisiertes und optimiertes WorMotel-Protokoll¹⁵.

Jede Einzelschneckenkulturumgebung besteht aus einem Mikrotablett, das mit einem kundenspezifischen 3D-gedruckten Adapter in einem Standard-Single-Well-Tray montiert ist (Abbildung 1A). Die Vertiefungen sind mit niedrigschmelzenden Agarose-Nematoden-Wachstumsmedien (lmNGM) gefüllt, die mit konzentrierten Bakterien als Nahrungsquelle besiedelt und von einer Palmitinsäurebeschichtung umgeben sind, um die Flucht der Würmer zu verhindern (Abbildung 1B). Der Raum zwischen der Mikroschale und den Wänden der Single-Well-Platte ist mit gesättigten Wasserkristallen gefüllt, um die Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten (Abbildung 1B). Der Tablettdeckel wird mit einer Reinigungsmittelbeschichtung versehen, um Kondensation zu verhindern. In jede Vertiefung wird eine einzelne Schnecke gegeben, und die Einvertiefungsschale ist mit Parafilm versiegelt, um die Feuchtigkeit zu erhalten und den Sauerstoffaustausch zu ermöglichen. Bis zu sechs Microtrays können von einem einzigen erfahrenen Forscher sinnvoll parallel präpariert werden.

Protocol

1. Rezepte Anmerkungen: Bereiten Sie Stammlösungen vor, bevor Sie mit der Vorbereitung der Mikroschalenplatte beginnen. Lagerlösungen für niedrigschmelzende Agarosenematoden-Nährmedien (lmNGM)Bereiten Sie 1 M K 2 HPO4 vor, indem Sie 174,18 g K2HPO4in 1 l sterilem deionisiertem Wasser in einer 1-Liter-Flasche auflösen. Autoklavieren Sie die Lösung bei 121 °C, 15 psi, für 30 Minuten und lagern Sie sie bei Raumtemperatur …

Representative Results

Die hier beschriebene Mikroschalen-basierte Einzelwurmkulturumgebung kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Phänotypen zu überwachen, einschließlich Lebens- und Gesundheitsspanne, Aktivität und Bewegung, Körperform und Krabbelgeometrie sowie die Expression transgen exprimierter fluoreszierender Biomarker in einzelnen Tieren über die Zeit. Das Mikroschalen-Kultursystem ist mit der Lebensdaueranalyse kompatibel, entweder durch manuelles Scoring oder durch Bilderfassung und nachgeschaltete Bildgebungsanalyse. Wie…

Discussion

In dieser Arbeit beschreiben wir ein neuartiges Kultursystem, das Mikroschalen, die ursprünglich für humane Leukozytenantigen-Gewebetypisierungsassays entwickelt wurden, so anpasst, dass sie die Isolierung und Charakterisierung einzelner C. elegans im Laufe der Zeit in einer festen Medienumgebung ermöglichen, die kontextuell dem Agar-basierten NGM ähnelt, das der Standard in der C. elegans-Forschung ist. Dieses System ist mit einer Vielzahl von Interventionen kompatibel, darunter diätetische Restr…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP