Cultura de Longo Prazo de Caenorhabditis elegans Individuais em Meio Sólido para Monitoramento Longitudinal de Fluorescência e Intervenções Aversivas

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para cultura de isolados de nematoides individuais em meio sólido para rastreamento de parâmetros fisiológicos ao longo da vida e quantificação de fluorescência. Este sistema de cultura inclui uma barreira de ácido palmítico ao redor de poços de verme único para evitar a fuga de animais, permitindo o uso de intervenções aversivas, incluindo bactérias patogênicas e estressores químicos.

Abstract

Caenorhabditis elegans são amplamente utilizados para estudar a biologia do envelhecimento. A prática padrão em estudos de envelhecimento de C. elegans é cultivar grupos de vermes em meios de crescimento de nematoides sólidos (NGM), permitindo a coleta eficiente de dados em nível populacional para sobrevivência e outros fenótipos fisiológicos, e amostragem periódica de subpopulações para quantificação de biomarcadores fluorescentes. As limitações dessa abordagem são a incapacidade de (1) acompanhar vermes individuais ao longo do tempo para desenvolver trajetórias etárias para fenótipos de interesse e (2) monitorar biomarcadores fluorescentes diretamente no contexto do ambiente de cultura. Abordagens de cultura alternativa usam cultura líquida ou microfluídica para monitorar animais individuais ao longo do tempo, em alguns casos incluindo quantificação de fluorescência, com a compensação de que o ambiente de cultura é contextualmente distinto do NGM sólido. O WorMotel é um dispositivo multipoço microfabricado previamente descrito para o cultivo de vermes isolados em NGM sólido. Cada verme é mantido em um poço contendo NGM sólido cercado por um fosso preenchido com sulfato de cobre, um repelente de contato para C. elegans, permitindo o monitoramento longitudinal de animais individuais. Achamos o sulfato de cobre insuficiente para evitar que vermes fujam quando submetidos a intervenções aversivas comuns em pesquisas sobre envelhecimento, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas e agentes químicos que induzem estresse celular. Os dispositivos multipoços também são moldados a partir de polidimetilsiloxano, que produz artefatos de alto fundo em imagens de fluorescência. Este protocolo descreve uma nova abordagem para o cultivo de lombrigas isoladas em NGM sólido usando microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente, originalmente projetadas para tipagem de antígenos leucocitários humanos (HLA), permitindo a medição da sobrevivência, fenótipos fisiológicos e fluorescência ao longo da vida. Uma barreira de ácido palmítico impede que os vermes fujam, mesmo na presença de condições aversivas. Cada placa pode cultivar até 96 animais e se adapta facilmente a uma variedade de condições, incluindo restrição alimentar, RNAi e aditivos químicos, e é compatível com sistemas automatizados para coletar dados de vida útil e atividade.

Introduction

C. elegans é um poderoso organismo modelo para pesquisas em genética, biologia celular e biologia molecular, pois são facilmente cultivadas em laboratório, têm curto tempo de geração e vida útil, compartilham alto grau de homologia proteica com mamíferos e possuem estrutura corporal transparente que permite a visualização in vivo de proteínas fluorescentes e corantes¹. Como resultado do uso de longa data de C. elegans como um sistema modelo principal em uma variedade de campos, incluindo biologia do desenvolvimento e envelhecimento, seu crescimento e desenvolvimento são bem compreendidos, seu genoma foi totalmente sequenciado e uma série de ferramentas genéticas poderosas foram criadas, incluindo bibliotecas de alimentação de RNAi em todo o genoma e milhares de cepas mutantes e transgênicas. Historicamente, C. elegans são cultivadas como populações em meios de crescimento de nematoides sólidos em ágar (NGM), e os fenótipos são avaliados manualmente por observação direta ou por imagem e análise a jusante. A microscopia fluorescente é usada para capturar uma variedade de fenótipos moleculares usando corantes ou etiquetas fluorescentes transgenicamente expressas em C. elegans individuais. A imagem fluorescente geralmente envolve a fixação ou paralisação de um animal em lâminas contendo almofadas finas de agarose, o que é invasivo e muitas vezes letal. Envolve também o uso de substâncias químicas, como levamisol ou azida sódica, que potencialmente podem interferir no processo molecular de interesse ^2,3. Juntas, essas abordagens permitem que dados transversais em nível populacional sejam coletados em uma ampla gama de fenótipos, mas não permitem o rastreamento de animais individuais ao longo do tempo.

Nos últimos anos, várias abordagens têm surgido para cultivar C. elegans isolados, permitindo aos pesquisadores capturar mudanças dinâmicas nos fenótipos fisiológicos e moleculares de animais ao longo do tempo utilizando novas tecnologias de imagem. Uma categoria de abordagem de cultura de C. elegans são os dispositivos microfluídicos, incluindo o WormFarm⁴, o chip Nemalife⁵ e o chip ‘comportamento’ de Chronis et ^al.6, entre vários outros ^7,8,9. Relacionados a estes estão os métodos de cultura em base líquida, que utilizam placas de poços múltiplos para caracterizar vermes individuais ou pequenas populações ao longo do tempo^10,11. Sistemas microfluídicos e de microplacas fornecem excelentes medidas quantitativas de respostas fenotípicas em C. elegans até um único animal, mas o ambiente de cultura apresenta uma limitação fundamental. A grande maioria das pesquisas anteriores em C. elegans, particularmente no campo do envelhecimento, foi concluída em meios sólidos baseados em ágar. A cultura líquida faz com que C. elegans nade continuamente e representa um contexto ambiental distinto que pode alterar a biologia subjacente. Por exemplo, animais cultivados em meio líquido alteraram drasticamente o conteúdo de gordura e a expressão gênica — particularmente para genes envolvidos na resposta ao estresse — em relação a animais cultivados em NGM sólida à base de ágar^12,13. Uma categoria alternativa de métodos de imagem de um único animal envolve dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que isolam animais individuais em meios sólidos, em um esforço para mimetizar mais de perto o ambiente padrão experimentado por vermes cultivados em NGM sólido em cultura de grupo em placas de Petri. O WorMotel é um dispositivo PDMS de 240 poços projetado para cultivar animais individuais em mídia sólida. Cada poço é preenchido com um NGM modificado usando agarose de baixo derretimento no lugar do ágar e semeado com alimento bacteriano, criando um ambiente de meio sólido semelhante ao sistema de cultura mais comum usando placas de Petri. As paredes do poço são redondas, permitindo que cada animal seja fotografado independentemente da localização no poço (evitando o obscurecimento visual causado por um animal perto de uma parede em uma placa de vários poços). O sulfato de cobre em um fosso estreito ao redor de cada poço é usado como dissuasor para manter os animais em seus poços^14,15. Uma limitação dessa abordagem é que o sulfato de cobre é ineficaz para impedir a fuga de vermes quando condições ambientais aversivas estão presentes, incluindo restrição alimentar, bactérias patogênicas ou produtos químicos que induzem estresse celular (por exemplo, paraquat).

Um segundo sistema que utiliza meios sólidos é o Worm Corral, que emprega um hidrogel para criar um pequeno ambiente selado para cada verme em uma lâmina, permitindo o monitoramento a longo prazo de animais isolados individualmente¹⁶. Uma limitação fundamental é que os animais devem ser selados no ambiente como ovos, exigindo o uso de animais estéreis para evitar a reprodução e limitando os tratamentos medicamentosos a uma única aplicação. Ensaios de drogas multidose podem ser realizados no WorMotel realizando várias rodadas de exposição antes de transferir vermes para o dispositivo ou adicionando topicamente drogas adicionais aos poços durante o experimento; No entanto, neste último caso, a dose de exposição real após a adição de um medicamento adicional a um poço existente é difícil de quantificar com precisão e depende da rapidez com que o medicamento se degrada. Tanto o WorMotel quanto o Worm Corral são excelentes para imagens de campo claro ou campo escuro para capturar informações relacionadas à atividade e fisiologia animal (por exemplo, crescimento e desenvolvimento). Embora esses sistemas possam ser usados para monitorar a fluorescência, em nossa experiência, o PDMS usado para criar as outras tecnologias de imagem de worm único é propenso a formar microbolhas, capturar partículas e outras pequenas anormalidades que geram artefatos fluorescentes irregulares que interferem na visualização e quantificação consistentes de fluorescência, especialmente na faixa de emissão de GFP, o fluoróforo mais comum usado na pesquisa de C. elegans. Até o momento, imagens de fluorescência viva de animais individuais de C. elegans de forma longitudinal dependem principalmente de dispositivos microfluídicos¹⁷.

Aqui, descrevemos um novo método para cultivo de C. elegans individuais em meios sólidos que é compatível com intervenções aversivas e imagens fluorescentes diretas. Essa abordagem é semelhante em conceito a outras tecnologias de imagem de worm único, exceto que o chip PDMS moldado sob medida é substituído por microbandejas de poliestireno disponíveis comercialmente originalmente desenvolvidas para ensaios de microcitotoxicidade (também comumente chamadas de bandejas Terasaki)¹⁸. Essas microbandejas apresentam poços que podem ser preenchidos com meio sólido e semeados com alimento bacteriano, imitando de perto o ambiente experimentado pelos animais sob a metodologia padrão de cultura sólida NGM. Cada poço é cercado por uma barreira aversiva de ácido palmítico em vez de sulfato de cobre. O ácido palmítico é comumente usado para evitar que vermes fujam de meios sólidos, usando cultura de grupo padrão em placas de Petri em experimentos onde os vermes são desafiados com um ambiente aversivo, como restrição alimentar ou exposição a um estressor químico. As microbandejas também produzem fundo fluorescente mínimo e consistente, permitindo imagens fluorescentes de animais diretamente em seu ambiente de cultura. Este novo sistema de cultura baseado em ágar sólido de animal único não só permite rastrear animais individuais ao longo da vida e monitorar o crescimento, desenvolvimento, atividade e tempo de vida, mas também é compatível com microscopia fluorescente direta. Como os vermes podem ser fotografados sem paralisia ou fixação, biomarcadores de fluorescência in vivo podem ser quantificados longitudinalmente em animais individuais remanescentes em seus meios de cultura, permitindo a observação de mudanças dinâmicas ao longo da vida de cada animal. Esse sistema de cultura também é compatível com sistemas automatizados de geração atual para rastreamento da vida útil e outras métricas de saúde^14,19. Nós fornecemos um protocolo detalhado para a cultura de C. elegans individuais neste sistema baseado em microbandeja, discutimos possíveis armadilhas e solução de problemas, e discutimos as vantagens e limitações em relação a outros sistemas e, em particular, um protocolo WorMotel atualizado e otimizado¹⁵.

Cada ambiente de cultura de worm único consiste em uma microbandeja montada dentro de uma bandeja padrão de poço único usando um adaptador personalizado impresso em 3D (Figura 1A). Os poços são preenchidos com meios de crescimento de nematoides de agarose de baixo derretimento (lmNGM), semeados com bactérias concentradas como fonte de alimento e cercados por um revestimento de ácido palmítico para evitar a fuga de vermes (Figura 1B). O espaço entre a microbandeja e as paredes da placa de poço único é preenchido com cristais de água saturados para manter a umidade (Figura 1B). Um revestimento de detergente é aplicado na tampa da bandeja para evitar a condensação. Um único verme é adicionado a cada poço, e a bandeja de poço único é selada com Parafilm para manter a umidade e permitir a troca de oxigênio. Até seis microbandejas podem ser razoavelmente preparadas em paralelo por um único pesquisador praticante.

Protocol

1. Receitas NOTA: Prepare as soluções-mãe antes de iniciar a preparação da placa de microbandeja. Soluções estoque para meios de crescimento de nematoides de agarose de baixa fusão (lmNGM)Preparar 1 M K 2 HPO4 dissolvendo 174,18 g de K2HPO4 em 1L de água deionizada estéril num frasco de 1 L. Autoclave a solução a 121 °C, 15 psi, por 30 min e armazene-a à temperatura ambiente (TR). Preparar 1 M KPi…

Representative Results

O ambiente de cultura de worm único baseado em microbandeja descrito aqui pode ser usado para monitorar uma variedade de fenótipos, incluindo expectativa de vida e tempo de saúde, atividade e movimento, forma do corpo e geometria de rastejamento, e a expressão de biomarcadores fluorescentes transgenicamente expressos em animais individuais ao longo do tempo. O sistema de cultura de microbandejas é compatível com a análise da vida útil por meio de pontuação manual ou coleta de imagens e análise de imagens a jus…

Discussion

Aqui, descrevemos um novo sistema de cultura que adapta microbandejas, originalmente desenvolvido para ensaios de tipagem de tecido de antígenos leucocitários humanos, para permitir o isolamento e caracterização de C. elegans únicos ao longo do tempo em um ambiente de meio sólido que é contextualmente semelhante ao NGM à base de ágar que é o padrão na pesquisa de C. elegans. Esse sistema é compatível com uma variedade de intervenções, incluindo restrição alimentar, tratamento medicamen…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP