Langtidsdyrkning af individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier til langsgående fluorescensovervågning og aversive indgreb

Summary

Her præsenterer vi en protokol til dyrkning af isolerede individuelle nematoder på faste medier til livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantificering. Dette kultursystem omfatter en palmitinsyrebarriere omkring enkeltormbrønde for at forhindre dyr i at flygte, hvilket tillader anvendelse af aversive indgreb, herunder patogene bakterier og kemiske stressorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans bruges i vid udstrækning til at studere aldringsbiologi. Standardpraksis i C. elegans aldringsundersøgelser er at dyrke grupper af orme på faste nematodevækstmedier (NGM), hvilket muliggør effektiv indsamling af data på populationsniveau for overlevelse og andre fysiologiske fænotyper og periodisk prøveudtagning af subpopulationer til fluorescerende biomarkørkvantificering. Begrænsninger for denne tilgang er manglende evne til (1) at følge individuelle orme over tid for at udvikle aldersbaner for fænotyper af interesse og (2) overvåge fluorescerende biomarkører direkte i forbindelse med kulturmiljøet. Alternative dyrkningsmetoder bruger flydende kultur eller mikrofluidik til at overvåge individuelle dyr over tid, i nogle tilfælde inklusive fluorescenskvantificering, med den afvejning, at kulturmiljøet er kontekstuelt adskilt fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikeret multi-well enhed til dyrkning af isolerede orme på fast NGM. Hver orm opretholdes i en brønd, der indeholder fast NGM omgivet af en voldgrav fyldt med kobbersulfat, et kontaktafvisende middel til C. elegans, hvilket muliggør langsgående overvågning af individuelle dyr. Vi finder kobbersulfat utilstrækkeligt til at forhindre orme i at flygte, når de udsættes for aversive indgreb, der er almindelige i aldringsforskning, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier og kemiske agenser, der fremkalder cellulær stress. Multibrøndindretningerne er også støbt af polydimethylsiloxan, som producerer artefakter med høj baggrund i fluorescensbilleddannelse. Denne protokol beskriver en ny tilgang til dyrkning af isolerede rundorme på fast NGM ved hjælp af kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, oprindeligt designet til human leukocytantigen (HLA) typning, hvilket muliggør måling af overlevelse, fysiologiske fænotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer orme i at flygte, selv i nærvær af aversive forhold. Hver plade kan dyrke op til 96 dyr og tilpasser sig let til en række forhold, herunder diætbegrænsning, RNAi og kemiske tilsætningsstoffer, og er kompatibel med automatiserede systemer til indsamling af levetids- og aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans er en stærk modelorganisme til forskning inden for genetik, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de let dyrkes i laboratoriet, har en kort generationstid og levetid, deler en høj grad af proteinhomologi med pattedyr og har en gennemsigtig kropsstruktur, der tillader in vivo-visualisering af fluorescerende proteiner og farvestoffer¹. Som et resultat af den mangeårige brug af C. elegans som et vigtigt modelsystem på en række områder, herunder udviklingsbiologi og aldring, er deres vækst og udvikling godt forstået, deres genom er blevet fuldt sekventeret, og en lang række kraftfulde genetiske værktøjer er blevet skabt, herunder genom-wide RNAi fodring biblioteker og tusindvis af mutante og transgene stammer. Historisk set dyrkes C. elegans som populationer på fast agarnematodevækstmedie (NGM), og fænotyper evalueres manuelt enten ved direkte observation eller ved billeddannelse og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi bruges til at fange en række molekylære fænotyper ved hjælp af farvestoffer eller transgent udtrykte fluorescerende tags i individuelle C. elegans. Fluorescerende billeddannelse involverer typisk fastsættelse eller lammelse af et dyr på dias, der indeholder tynde agarosepuder, hvilket er invasivt og ofte dødeligt. Det involverer også brugen af kemikalier, såsom levamisol eller natriumazid, som potentielt kan forstyrre den molekylære proces af interesse ^2,3. Tilsammen gør disse tilgange det muligt at indsamle tværsnitsdata på populationsniveau på tværs af en bred vifte af fænotyper, men tillader ikke sporing af individuelle dyr over tid.

I de senere år er der opstået flere tilgange til dyrkning af isolerede C. elegans, hvilket gør det muligt for forskere at fange dynamiske ændringer i fysiologiske og molekylære fænotyper af dyr over tid ved hjælp af nye billeddannelsesteknologier. En kategori af C. elegans kultur tilgang er mikrofluidik enheder, herunder WormFarm⁴, Nemalife chip⁵, og ‘adfærd’ chip af Chronis et ^al.6, blandt forskellige andre ^7,8,9. Relateret til disse er væskebaserede dyrkningsmetoder, der bruger multibrøndplader til at karakterisere individuelle orme eller små populationer over tid^10,11. Mikrofluidik og mikropladesystemer giver fremragende kvantitative målinger af fænotypiske reaktioner i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet udgør en vigtig begrænsning. Langt størstedelen af tidligere forskning i C. elegans, især inden for aldring, er blevet afsluttet på faste agarbaserede medier. Flydende kultur får C. elegans til at svømme kontinuerligt og repræsenterer en særskilt miljømæssig kontekst, der kan ændre den underliggende biologi. For eksempel har dyr, der dyrkes i flydende medier, drastisk ændret fedtindhold og genekspression – især for gener, der er involveret i stressresponsen – i forhold til dyr, der dyrkes på agarbaseret fast NGM^12,13. En alternativ kategori af billeddannelsesmetoder med et enkelt dyr involverer polydimethylsiloxan (PDMS) enheder, der isolerer individuelle dyr på faste medier i et forsøg på nærmere at efterligne standardmiljøet, der opleves af orme dyrket på fast NGM i gruppekultur på petriplader. WorMotel er en 240-brønds PDMS-enhed designet til at dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønd er fyldt med en modificeret NGM ved hjælp af lavsmeltet agarose i stedet for agar og podet med bakteriel mad, hvilket skaber et solidt mediemiljø svarende til det mest almindelige kultursystem ved hjælp af petriplader. Brøndvæggene er runde, så hvert dyr kan afbildes uanset placering i brønden (undgå visuel tilsløring forårsaget af et dyr nær en væg i en plade med flere brønde). Kobbersulfat i en smal voldgrav, der omgiver hver brønd, bruges som afskrækkende middel til at holde dyr i deres brønde^14,15. En begrænsning af denne tilgang er, at kobbersulfatet er ineffektivt til at forhindre orme i at flygte, når aversive miljøforhold er til stede, herunder diætbegrænsning, patogene bakterier eller kemikalier, der fremkalder cellulær stress (f.eks. Paraquat).

Et andet system, der bruger faste medier, er Worm Corral, som anvender en hydrogel til at skabe et lille forseglet miljø for hver orm på et dias, hvilket muliggør langsigtet overvågning af individuelt isolerede dyr¹⁶. En vigtig begrænsning er, at dyr skal forsegles i miljøet som æg, hvilket kræver brug af sterile dyr for at forhindre reproduktion og begrænser lægemiddelbehandlinger til en enkelt applikation. Multi-dosis lægemiddelforsøg kan udføres i WorMotel enten ved at gennemføre flere eksponeringsrunder inden overførsel af orme til enheden eller ved topisk at tilføje yderligere lægemidler til brøndene under eksperimentet; I sidstnævnte tilfælde er den faktiske eksponeringsdosis efter tilsætning af et yderligere lægemiddel til en eksisterende brønd imidlertid vanskelig at kvantificere præcist og afhænger af, hvor hurtigt lægemidlet nedbrydes. Både WorMotel og Worm Corral er fremragende til brightfield eller darkfield billeddannelse for at fange information relateret til aktivitet og dyrefysiologi (fx vækst og udvikling). Mens disse systemer kan bruges til at overvåge fluorescens, er det vores erfaring, at PDMS, der bruges til at skabe de andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, er tilbøjelige til at danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter, der genererer uregelmæssige fluorescerende artefakter, der forstyrrer konsekvent fluorescensvisualisering og kvantificering, især i emissionsområdet for GFP, den mest almindelige fluorofor, der anvendes i C. elegans-forskning. Hidtil er levende fluorescensbilleddannelse af C. elegans individuelle dyr på langsgående måde primært afhængig af mikrofluidiske enheder¹⁷.

Her beskriver vi en ny metode til dyrkning af individuelle C. elegans på faste medier, der er kompatibel med både aversive indgreb og direkte fluorescerende billeddannelse. Denne tilgang ligner i koncept andre enkeltormsbilleddannelsesteknologier, bortset fra at den specialstøbte PDMS-chip erstattes med kommercielt tilgængelige polystyrenmikrobakker, der oprindeligt blev udviklet til mikrocytotoksicitetsassays (også almindeligvis kaldet Terasaki-bakker)¹⁸. Disse mikrobakker har brønde, der kan fyldes med faste medier og podes med bakteriel mad, der nøje efterligner det miljø, som dyr oplever under standard solid NGM-kulturmetode. Hver brønd er omgivet af en aversiv barriere af palmitinsyre snarere end kobbersulfat. Palmitinsyre bruges almindeligvis til at forhindre orme i at flygte fra faste medier ved hjælp af standardgruppekultur på petriplader i forsøg, hvor orme udfordres med et aversivt miljø som diætbegrænsning eller udsættelse for en kemisk stressor. Mikrobakkerne producerer også minimal og konsistent fluorescerende baggrund, hvilket muliggør fluorescerende billeddannelse af dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye enkeltdyrs faste agarbaserede dyrkningssystem giver ikke kun mulighed for at spore individuelle dyr gennem hele livet og overvåge vækst, udvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan afbildes uden lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantificeres i længderetningen hos individuelle dyr, der forbliver på deres kulturmedier, hvilket muliggør observation af dynamiske ændringer i løbet af hvert dyrs levetid. Dette kultursystem er også kompatibelt med den nuværende generation af automatiserede systemer til sporing af levetid og andre sundhedsmålinger^14,19. Vi leverer en detaljeret protokol til dyrkning af individuelle C. elegans i dette mikrobakkebaserede system, diskutere potentielle faldgruber og fejlfinding og diskutere fordele og begrænsninger i forhold til andre systemer, og især en opdateret og optimeret WorMotel-protokol¹⁵.

Hvert kulturmiljø med en enkelt orm består af en mikrobakke monteret inde i en standard enkeltbrøndsbakke ved hjælp af en brugerdefineret 3D-printet adapter (figur 1A). Brøndene er fyldt med lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM), podet med koncentrerede bakterier som fødekilde og omgivet af en palmitinsyrebelægning for at forhindre orme i at flygte (figur 1B). Mellemrummet mellem mikrobakken og væggene på enkeltbrøndpladen er fyldt med mættede vandkrystaller for at opretholde fugtighed (figur 1B). En vaskemiddelbelægning påføres bakkelåget for at forhindre kondens. En enkelt orm tilsættes til hver brønd, og enkeltbrøndbakken forsegles med Parafilm for at opretholde fugt og tillade iltudveksling. Op til seks mikrobakker kan med rimelighed fremstilles parallelt af en enkelt praktiseret forsker.

Protocol

1. Opskrifter BEMÆRK: Forbered stamopløsninger, inden du starter forberedelsen af mikrobakkepladen. Stamopløsninger til lavsmeltet agarosenematodevækstmedier (lmNGM)Der fremstilles 1 M K2HPO4 ved at opløse 174,18 gK2HPO4i1 liter sterilt deioniseret vand i en 1 liter flaske. Opløsningen autoklaveres ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og opbevares ved stuetemperatur (RT). Der fremstilles 1 M KP i (pH6,0</su…

Representative Results

Det mikrobakkebaserede enkeltormskulturmiljø, der er beskrevet her, kan bruges til at overvåge en række fænotyper, herunder levetid og sundhedsperiode, aktivitet og bevægelse, kropsform og kravlegeometri og ekspression af transgent udtrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobakkekultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gennem enten manuel scoring eller billedindsamling og downstream-billedanalyse. Som med standardkultur på petriplader21 kan orme manuelt…

Discussion

Her beskriver vi et nyt kultursystem, der tilpasser mikrobakker, oprindeligt udviklet til humane leukocytantigenvævstypeassays, for at muliggøre isolering og karakterisering af enkelte C. elegans over tid i et solidt mediemiljø, der kontekstuelt ligner den agarbaserede NGM, der er standarden i C. elegans-forskning. Dette system er kompatibelt med en række interventioner, herunder diætbegrænsning, eksogen lægemiddelbehandling, en udfordring med kemiske eller miljømæssige stressfaktorer og RNAi…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP