Langsiktig kultur av individuelle Caenorhabditis elegans på faste medier for langsgående fluorescensovervåking og aversive intervensjoner

Summary

Her presenterer vi en protokoll til dyrkningsisolerte individuelle nematoder på faste medier for livslang fysiologisk parametersporing og fluorescenskvantifisering. Dette kultursystemet inkluderer en palmitinsyrebarriere rundt enkeltormbrønner for å forhindre at dyr flykter, noe som tillater bruk av aversive inngrep, inkludert patogene bakterier og kjemiske stressorer.

Abstract

Caenorhabditis elegans er mye brukt til å studere aldringsbiologi. Standard praksis i C. elegans aldringsstudier er å dyrke grupper av ormer på faste nematodevekstmedier (NGM), noe som muliggjør effektiv innsamling av populasjonsnivådata for overlevelse og andre fysiologiske fenotyper, og periodisk prøvetaking av subpopulasjoner for fluorescerende biomarkørkvantifisering. Begrensninger for denne tilnærmingen er manglende evne til å (1) følge individuelle ormer over tid for å utvikle aldersbaner for fenotyper av interesse og (2) overvåke fluorescerende biomarkører direkte i sammenheng med kulturmiljøet. Alternative kulturtilnærminger bruker flytende kultur eller mikrofluidikk for å overvåke individuelle dyr over tid, i noen tilfeller inkludert fluorescenskvantifisering, med avveiningen at kulturmiljøet er kontekstuelt forskjellig fra fast NGM. WorMotel er en tidligere beskrevet mikrofabrikert flerbrønnsenhet for dyrking av isolerte ormer på fast NGM. Hver orm opprettholdes i en brønn som inneholder fast NGM omgitt av en vollgrav fylt med kobbersulfat, et kontaktmiddel for C. elegans, som tillater langsgående overvåking av individuelle dyr. Vi finner kobbersulfat utilstrekkelig til å forhindre ormer i å flykte når de blir utsatt for aversive inngrep som er vanlige i aldringsforskning, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier og kjemiske midler som induserer cellulær stress. Multibrønnsenhetene er også støpt fra polydimetylsiloksan, som produserer høye bakgrunnsartefakter i fluorescensavbildning. Denne protokollen beskriver en ny tilnærming for dyrking av isolerte rundorm på fast NGM ved bruk av kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett, opprinnelig designet for human leukocyttantigen (HLA) typing, som tillater måling av overlevelse, fysiologiske fenotyper og fluorescens over hele levetiden. En palmitinsyrebarriere forhindrer ormer i å flykte, selv i nærvær av aversive forhold. Hver tallerken kan dyrke opptil 96 dyr og tilpasser seg enkelt til en rekke forhold, inkludert diettbegrensning, RNAi og kjemiske tilsetningsstoffer, og er kompatibel med automatiserte systemer for innsamling av levetid og aktivitetsdata.

Introduction

C. elegans er en kraftig modellorganisme for forskning innen genetikk, cellulær biologi og molekylærbiologi, fordi de lett dyrkes i laboratoriet, har kort generasjonstid og levetid, deler en høy grad av proteinhomologi med pattedyr og har en gjennomsiktig kroppsstruktur som tillater in vivo visualisering av fluorescerende proteiner og fargestoffer¹. Som et resultat av den langvarige bruken av C. elegans som et viktig modellsystem på en rekke felt, inkludert utviklingsbiologi og aldring, er deres vekst og utvikling godt forstått, deres genom har blitt fullstendig sekvensert, og en rekke kraftige genetiske verktøy er opprettet, inkludert genombrede RNAi-fôringsbiblioteker og tusenvis av mutante og transgene stammer. Historisk dyrkes C. elegans som populasjoner på faste agarnematodevekstmedier (NGM), og fenotyper evalueres manuelt enten ved direkte observasjon eller ved avbildning og nedstrømsanalyse. Fluorescerende mikroskopi brukes til å fange en rekke molekylære fenotyper ved hjelp av fargestoffer eller transgent uttrykte fluorescerende koder i individuelle C. elegans. Fluorescerende avbildning innebærer vanligvis å fikse eller lamme et dyr på lysbilder som inneholder tynne agaroseputer, noe som er invasivt og ofte dødelig. Det innebærer også bruk av kjemikalier, som levamisol eller natriumazid, som potensielt kan forstyrre den molekylære prosessen av interesse ^2,3. Sammen gjør disse tilnærmingene det mulig å samle inn data på tverrsnittsnivå på populasjonsnivå over et bredt spekter av fenotyper, men tillater ikke sporing av individuelle dyr over tid.

I de senere år har flere tilnærminger dukket opp for å dyrke isolerte C. elegans, slik at forskere kan fange dynamiske endringer i fysiologiske og molekylære fenotyper av dyr over tid ved hjelp av nye bildebehandlingsteknologier. En kategori av C. elegans kultur tilnærming er microfluidics enheter, inkludert WormFarm⁴, Nemalife chip⁵, og “atferd” chip av Chronis et ^al.6, blant annet ^7,8,9. Relatert til disse er væskebaserte kulturmetoder, som bruker flerbrønnsplater for å karakterisere individuelle ormer eller små populasjoner over tid^10,11. Mikrofluidikk og mikroplatesystemer gir gode kvantitative målinger av fenotypiske responser i C. elegans ned til et enkelt dyr, men kulturmiljøet presenterer en viktig begrensning. Det store flertallet av tidligere forskning i C. elegans, spesielt innen aldring, har blitt fullført på solide agarbaserte medier. Flytende kultur får C. elegans til å svømme kontinuerlig og representerer en distinkt miljøkontekst som kan endre den underliggende biologien. For eksempel har dyr dyrket i flytende medier drastisk endret fettinnhold og genuttrykk – spesielt for gener involvert i stressresponsen – i forhold til dyr dyrket på agarbasert fast NGM^12,13. En alternativ kategori av enkeltdyravbildningsmetoder involverer polydimetylsiloksan (PDMS) enheter som isolerer individuelle dyr på faste medier, i et forsøk på å etterligne standardmiljøet som oppleves av ormer dyrket på fast NGM i gruppekultur på petrisklater. WorMotel er en 240-brønns PDMS-enhet designet for å dyrke individuelle dyr på faste medier. Hver brønn er fylt med en modifisert NGM ved bruk av lavsmelteagarose i stedet for agar og frøet med bakteriell mat, noe som skaper et solid mediemiljø som ligner på det vanligste kultursystemet ved bruk av petrisklater. Brønnveggene er runde, slik at hvert dyr kan avbildes uavhengig av plassering i brønnen (unngå visuell tilsløring forårsaket av et dyr nær en vegg i en flerbrønnsplate). Kobbersulfat i en smal vollgrav som omgir hver brønn brukes som avskrekkende for å holde dyr i brønnene^{sine 14,15}. En begrensning av denne tilnærmingen er at kobbersulfatet er ineffektivt for å hindre ormer i å flykte når aversive miljøforhold er tilstede, inkludert diettbegrensning, patogene bakterier eller kjemikalier som induserer cellulær stress (f.eks. Paraquat).

Et annet system som bruker faste medier er Worm Corral, som benytter en hydrogel for å skape et lite forseglet miljø for hver orm på et lysbilde, noe som muliggjør langsiktig overvåking av individuelt isolerte dyr¹⁶. En viktig begrensning er at dyr må forsegles i miljøet som egg, noe som krever bruk av sterile dyr for å forhindre reproduksjon, og begrenser medikamentell behandling til en enkelt applikasjon. Multi-dose narkotika forsøk kan oppnås i WorMotel enten ved å gjennomføre flere runder med eksponering før overføring av ormer til enheten eller ved lokalt å legge til flere legemidler til brønnene under forsøket; I sistnevnte tilfelle er imidlertid den faktiske eksponeringsdosen etter tilsetning av et ekstra legemiddel til en eksisterende brønn vanskelig å nøyaktig kvantifisere og avhenger av hvor raskt stoffet nedbrytes. Både WorMotel og Worm Corral er utmerket for brightfield eller darkfield imaging for å fange opp informasjon relatert til aktivitet og dyrefysiologi (f.eks. Vekst og utvikling). Selv om disse systemene kan brukes til å overvåke fluorescens, er PDMS som brukes til å lage de andre enkeltormbildeteknologiene, etter vår erfaring tilbøyelige til å danne mikrobobler, fange partikler og andre små abnormiteter som genererer uregelmessige fluorescerende artefakter som forstyrrer konsistent fluorescensvisualisering og kvantifisering, spesielt i utslippsområdet for GFP, den vanligste fluoroforen som brukes i C. elegans-forskning. Til dags dato er levende fluorescensavbildning av C. elegans individuelle dyr på en langsgående måte primært avhengig av mikrofluidiske enheter¹⁷.

Her beskriver vi en ny metode for dyrking av individuelle C. elegans på faste medier som er kompatibel med både aversive inngrep og direkte fluorescerende avbildning. Denne tilnærmingen ligner i konsept til andre enkeltormbildeteknologier, bortsett fra at den spesialstøpte PDMS-brikken erstattes med kommersielt tilgjengelige polystyrenmikrobrett opprinnelig utviklet for mikrocytotoksisitetsanalyser (også ofte kalt Terasaki-brett)¹⁸. Disse mikrobrettene har brønner som kan fylles med faste medier og frøes med bakteriefôr, noe som etterligner miljøet som oppleves av dyr under standard solid NGM-kulturmetodikk. Hver brønn er omgitt av en aversiv barriere av palmitinsyre i stedet for kobbersulfat. Palmitinsyre brukes ofte til å forhindre ormer fra å flykte fra faste medier, ved hjelp av standard gruppekultur på petrisklater i eksperimenter der ormer utfordres med et aversivt miljø som diettbegrensning eller eksponering for en kjemisk stressor. Mikrobrettene produserer også minimal og konsistent fluorescerende bakgrunn, noe som tillater fluorescerende avbildning av dyr direkte i deres kulturmiljø. Dette nye solide agarbaserte kultursystemet med ett dyr gjør det ikke bare mulig å spore individuelle dyr gjennom livet og overvåke vekst, utvikling, aktivitet og levetid, men er også kompatibelt med direkte fluorescerende mikroskopi. Fordi ormene kan avbildes uten lammelse eller fiksering, kan in vivo fluorescensbiomarkører kvantifiseres i lengderetningen hos individuelle dyr som forblir på deres kulturmedier, slik at man kan observere dynamiske endringer i løpet av hvert dyrs levetid. Dette kultursystemet er også kompatibelt med nåværende generasjons automatiserte systemer for sporing av levetid og andre helsemålinger^14,19. Vi gir en detaljert protokoll for dyrking av individuelle C. elegans i dette mikroskuffbaserte systemet, diskuterer potensielle fallgruver og feilsøking, og diskuterer fordeler og begrensninger i forhold til andre systemer, og spesielt en oppdatert og optimalisert WorMotel-protokoll¹⁵.

Hvert kulturmiljø med én orm består av et mikrobrett montert inne i et standard enkeltbrønnsbrett ved hjelp av en tilpasset 3D-printet adapter (figur 1A). Brønnene er fylt med lavsmelte agarose nematode vekstmedier (lmNGM), sådd med konsentrerte bakterier som matkilde, og omgitt av et palmitinsyrebelegg for å hindre ormer i å flykte (figur 1B). Rommet mellom mikrobrettet og veggene på enkeltbrønnsplaten er fylt med mettede vannkrystaller for å opprettholde fuktighet (figur 1B). Et vaskemiddelbelegg påføres brettlokket for å forhindre kondens. En enkelt orm legges til hver brønn, og enkeltbrønnsbrettet er forseglet med Parafilm for å opprettholde fuktighet og tillate oksygenutveksling. Opptil seks mikrobrett kan med rimelighet tilberedes parallelt av en enkelt praktisert forsker.

Protocol

1. Oppskrifter NOTAT: Forbered lagerløsninger før du starter klargjøring av mikrobrettplater. Stamløsninger for vekstmedier med agarosenematode med lav smeltekraft (lmNGM)Forbered 1 MK2 HPO4 ved å oppløse 174,18 g K2HPO4 i 1 liter sterilt avionisert vann i en 1 l flaske. Autoklav oppløsningen ved 121 °C, 15 psi, i 30 minutter og oppbevar den ved romtemperatur (RT). Forbered 1 M KP i (pH 6,0) ved å oppløse …

Representative Results

Det mikrobrettbaserte enkeltormkulturmiljøet som er beskrevet her, kan brukes til å overvåke en rekke fenotyper, inkludert levetid og helsespenn, aktivitet og bevegelse, kroppsform og krypende geometri, og uttrykket av transgent uttrykte fluorescerende biomarkører hos individuelle dyr over tid. Mikrobrettkultursystemet er kompatibelt med levetidsanalyse gjennom enten manuell scoring eller bildeinnsamling og nedstrøms bildeanalyse. Som med standardkultur på petrisklate21, kan ormer manuelt sk…

Discussion

Her beskriver vi et nytt kultursystem som tilpasser mikroskuffer, opprinnelig utviklet for humane leukocyttantigenvevstypingsanalyser, for å tillate isolering og karakterisering av enkelt C. elegans over tid i et solid mediemiljø som er kontekstuelt lik den agarbaserte NGM som er standarden i C. elegans forskning. Dette systemet er kompatibelt med en rekke inngrep, inkludert diettbegrensning, eksogen medikamentell behandling, en utfordring med kjemiske eller miljømessige stressorer og RNAi. Det till…

Materials

3D-printed terasaki inserts	Custom printing company	Robot_Terasaki_tray_insert_10-20 -2021.STL	FDM printing, nozzle size 0.6 mm using standard PLA plus filament
AirClean systems AC624LF vertical laminar flow fume hood	Fisher Scientific	36-100-4376
Bacto peptone	Thermo Scientific	211677
CaCl2	Acros organics	349615000
Caenorhabditis elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	N2	Wildtype strain
Carbenicillin	Goldbio	C-103-25
Cholesterol	ICN Biomedicals Inc	101380
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	OP50	Standard labratory food for C. elegans
Ethanol	Millipore	ex0276-4
Fisher Vortex Genie 2	Fisher Scientific	G-560
FUdR	Research Products International	F10705-1.0
Hydrating water crystals	M2 Polymer Technologies	Type S	Type S super absorbent polymer
Isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	GoldBio	I2481C100
K2HPO4	Fisher Chemical	P288-500
Kimwipes	KimTech	34155	Task wipes
LB Broth, Lennox	BD Difco	240230
Leica K5 sCMOS monochrome camera	Leica Microsystems	11547112
Leica M205 FCA Fluorescent Stereo Microscope	Leica Microsystems	10450826
Low-melt agarose	Research Products International	A20070-250.0
MgSO4	Fisher Chemical	M-8900
NaCl	Fisher bioreagents	BP358-1
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Scientific	264728
Nystatin	Sigma	N1538
Palmitic acid	Acros organics	129700010
Paper towels	Coastwide Professional	365374
Parafilm M	Parafilm	16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400	Stratagene	400075	UV crosslinker
Terasaki trays (Lambda)	One Lambda	151431
Thermolyne Dri-bath	Thermolyne	DB28125
Tween	Thermo Scientific	J20605-AP