Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הערכת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים במבחנה

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64712
Automatic Translation
1, 3, 1,2,3
1Microbiology Graduate Program, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside, 3Materials Science & Engineering Program, University of California, Riverside

Summary

אנו מציגים ארבע שיטות להערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים באמצעות טכניקות in vitro . שיטות אלה יכולות להיות מותאמות לחקר האינטראקציות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים שונים עם מגוון רחב של מיני מיקרובים.

Abstract

הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים, כגון כסף, תחמוצת אבץ, טיטניום דו-חמצני ותחמוצת מגנזיום, נחקרה בעבר בסביבות קליניות וסביבתיות ובמוצרי מזון מתכלים. עם זאת, חוסר עקביות בשיטות הניסוי ובחומרים שבהם נעשה שימוש הביא לתוצאות סותרות, אפילו בקרב מחקרים על אותם סוגי ננו-מבנים ומיני חיידקים. עבור חוקרים המעוניינים להשתמש בננו-מבנים כתוסף או ציפוי בעיצוב מוצר, נתונים סותרים אלה מגבילים את השימוש בהם בסביבות קליניות.

כדי להתמודד עם דילמה זו, במאמר זה נציג ארבע שיטות שונות לקביעת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים, ונדון ביישומם בתרחישים שונים. התאמת שיטות עקביות צפויה להוביל לנתונים הניתנים לשחזור שניתן להשוות בין מחקרים וליישם עבור סוגי ננו-מבנים ומינים מיקרוביאליים שונים. אנו מציגים שתי שיטות לקביעת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים ושתי שיטות לפעילות האנטי-מיקרוביאלית של משטחים ננו-מבניים.

עבור ננו-חלקיקים, ניתן להשתמש בשיטת התרבית המשותפת הישירה כדי לקבוע את הריכוזים המעכבים המינימליים והמינימליים של קוטלי חיידקים של ננו-חלקיקים, וניתן להשתמש בשיטת תרבית החשיפה הישירה כדי להעריך פעילות בקטריוסטטית בזמן אמת לעומת פעילות חיידקית כתוצאה מחשיפה לננו-חלקיקים. עבור משטחים ננו-מבניים, שיטת התרבית הישירה משמשת לקביעת הכדאיות של חיידקים במגע עקיף וישיר עם משטחים ננו-מבניים, ושיטת החשיפה במגע ממוקד משמשת לבחינת פעילות מיקרוביאלית על אזור מסוים של משטח ננו-מבני. אנו דנים במשתני ניסוי מרכזיים שיש לקחת בחשבון עבור תכנון מחקר חוץ גופי בעת קביעת התכונות האנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים. כל השיטות הללו הן בעלות נמוכה יחסית, משתמשות בטכניקות שקל יחסית לשלוט בהן ולחזור עליהן לצורך עקביות, והן ישימות למגוון רחב של סוגי ננו-מבנים ומינים מיקרוביאליים.

Introduction

בארה"ב לבדה, 1.7 מיליון אנשים מפתחים זיהום נרכש בבית חולים (HAI) מדי שנה, כאשר אחד מכל 17 זיהומים אלה מסתיים במוות1. בנוסף, ההערכה היא כי עלויות הטיפול עבור HAIs נע בין 28 מיליארד $ ל 45 מיליארד $ בשנה 1,2. HAIs אלה נשלטים על ידי Staphylococcus aureus עמיד למתיצילין (MRSA)3,4 ו- Pseudomonas aeruginosa4, אשר מבודדים בדרך כלל מזיהומים כרוניים בפצע ובדרך כלל דורשים טיפול נרחב וזמן כדי לייצר תוצאה חיובית של המטופל.

במהלך העשורים האחרונים פותחו מספר סוגי אנטיביוטיקה לטיפול בזיהומים הקשורים לחיידקים פתוגניים אלה ואחרים. לדוגמה, אנלוגים rifamycin שימשו לטיפול MRSA, זיהומים אחרים גרם חיובי גרם שלילי, ו Mycobacterium spp. זיהומים5. בשנות התשעים, כדי לטפל ביעילות במספר גדל והולך של זיהומים שחפת, תרופות נוספות שולבו עם אנלוגים rifamycin כדי להגדיל את יעילותם. עם זאת, כ -5% ממקרי שחפת נשארים עמידיםלריפמפיצין5,6, ויש חשש גובר לגבי חיידקים עמידים לתרופות7. נכון לעכשיו, השימוש באנטיביוטיקה לבדה עשוי שלא להספיק בטיפול ב- HAIs, וזה עורר חיפוש מתמשך אחר טיפולים אנטי מיקרוביאליים חלופיים1.

מתכות כבדות, כגון כסף (Ag)8,9,10 וזהב (Au)11, וקרמיקה, כגון טיטניום דו-חמצני (TiO 2)12 ותחמוצת אבץ (ZnO)13, בצורת ננו-חלקיקים (NP) (AgNP, AuNP, TiO 2 NP ו-ZnONP, בהתאמה) נבדקו עבור פעילותן האנטי-מיקרוביאלית וזוהו כחלופות אנטיביוטיות פוטנציאליות. בנוסף, חומרים הניתנים לספיגה ביולוגית, כגון סגסוגות מגנזיום (סגסוגות MG)14,15,16, ננו-חלקיקי תחמוצת מגנזיום 17,18,19,20,21, וננו-חלקיקי מגנזיום הידרוקסיד [nMgO ו-nMg(OH)2, בהתאמה]22,23,24נבדקו גם., עם זאת, המחקרים האנטי-מיקרוביאליים הקודמים של ננו-חלקיקים השתמשו בחומרים ובשיטות מחקר לא עקביות, וכתוצאה מכך נתונים שקשה או בלתי אפשרי להשוות ולעתים סותרים באופיים18,19. לדוגמה, הריכוז המעכב המינימלי (MIC) והריכוז המינימלי של קוטלי חיידקים (MBC) של ננו-חלקיקי כסף השתנו באופן משמעותי במחקרים שונים. Ipe et al.25 העריכו את הפעילות האנטיבקטריאלית של AgNPs עם גודל חלקיקים ממוצע של ~ 26 ננומטר כדי לקבוע את MICs נגד חיידקים חיוביים גראם וחיידקים שליליים. ה-MICs שזוהו עבור P. aeruginosa, E. coli, S. aureus ו-MRSA היו 2 מיקרוגרם/מ"ל, 5 מיקרוגרם/מ"ל, 10 מיקרוגרם/מ"ל ו-10 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה. לעומת זאת, Parvekar et al.26 העריכו AgNPs עם גודל חלקיקים ממוצע של 5 ננומטר. במקרה זה, מיקרופון AgNP ו- MBC של 0.625 מ"ג / מ"ל נמצאו יעילים נגד S. aureus. בנוסף, Loo et al.27 העריכו AgNPs בגודל של 4.06 ננומטר. כאשר E. coli נחשף לננו-חלקיקים אלה, ה-MIC וה-MBC דווחו ב-7.8 מיקרוגרם/מ"ל. לבסוף, Ali et al.28 חקרו את התכונות האנטיבקטריאליות של AgNPs כדוריים בגודל ממוצע של 18 ננומטר. כאשר P. aeruginosa, E. coli ו-MRSA נחשפו לננו-חלקיקים אלה, המיקרופון זוהה ב-27 מיקרוגרם/מ"ל, 36 מיקרוגרם/מ"ל, 27 מיקרוגרם/מ"ל ו-36 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה, וה-MBC זוהה ב-36 מק"ג/מ"ל, 42 מיקרוגרם/מ"ל ו-30 מק"ג/מ"ל, בהתאמה.

למרות שהפעילות האנטי-בקטריאלית של ננו-חלקיקים נחקרה ודווחה בהרחבה במהלך העשורים האחרונים, אין תקן לחומרים ולשיטות המחקר המשמשים כדי לאפשר השוואה ישירה בין מחקרים. מסיבה זו אנו מציגים שתי שיטות, שיטת התרבית המשותפת הישירה (שיטה א') ושיטת החשיפה הישירה (שיטה ב'), לאפיון והשוואה של הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-חלקיקים תוך שמירה על עקביות החומרים והשיטות.

בנוסף לננו-חלקיקים, נבדקו גם משטחים ננו-מבניים לפעילות אנטיבקטריאלית. אלה כוללים חומרים מבוססי פחמן, כגון ננו-יריעות גרפן, ננו-צינוריות פחמן וגרפיט29, כמו גם סגסוגות Mg ו-Mg טהורות. כל אחד מהחומרים הללו הציג לפחות מנגנון אנטיבקטריאלי אחד, כולל נזק פיזי המוטל על קרום התא על ידי חומרים מבוססי פחמן ונזק לתהליכים מטבוליים או דנ"א באמצעות שחרור מיני חמצן תגובתי (ROS) כאשר Mg מתכלה. בנוסף, כאשר אבץ (Zn) וסידן (Ca) משולבים בהיווצרות סגסוגות MG, העידון של גודל גרגרי מטריצת Mg משופר, מה שמוביל לירידה בהידבקות חיידקים למשטחי המצע בהשוואה לדגימות Mg בלבד14. כדי להדגים פעילות אנטיבקטריאלית, אנו מציגים את שיטת התרבית הישירה (שיטה C), הקובעת הידבקות חיידקים על וסביב חומרים ננו-מבניים לאורך זמן באמצעות כימות יחידות יוצרות מושבות חיידקים (CFUs) עם מגע ישיר ועקיף עם פני השטח.

הגיאומטריה של ננו-מבנים על משטחים, כולל גודל, צורה והתמצאות, יכולה להשפיע על הפעילות החיידקית של חומרים. לדוגמה, Lin et al.16 יצרו שכבות MgO ננו-מובנות שונות על פני השטח של מצעי Mg באמצעות אנודיזציה ותצהיר אלקטרופורטי (EPD). לאחר תקופה של חשיפה למשטח הננו-מבני במבחנה, הצמיחה של S. aureus הופחתה באופן משמעותי בהשוואה ל- Mg שלא טופל. זה הצביע על עוצמה גדולה יותר של המשטח הננו-מבני כנגד הידבקות חיידקים לעומת משטח Mg מתכתי שאינו מטופל. כדי לחשוף את המנגנונים השונים של התכונות האנטיבקטריאליות של משטחים ננו-מבניים שונים, נדון במאמר זה שיטת חשיפה במגע ממוקד (שיטה D) הקובעת את אינטראקציות התא-פני השטח בתחום העניין.

מטרת מאמר זה היא להציג ארבע שיטות במבחנה הישימות לננו-חלקיקים שונים, משטחים ננו-מבניים ומינים מיקרוביאליים. אנו דנים בשיקולים מרכזיים עבור כל שיטה כדי להפיק נתונים עקביים הניתנים לשחזור לצורך השוואה. באופן ספציפי, שיטת התרבית המשותפת הישירה17 ושיטת החשיפה הישירה משמשות לבחינת התכונות האנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים. באמצעות שיטת התרבית המשותפת הישירה, ניתן לקבוע את ריכוזי החיידקים המעכבים והמינימליים (MIC ו- MBC90-99.99, בהתאמה) עבור מינים בודדים, וניתן לקבוע את הריכוז החזק ביותר (MPC) עבור מינים מרובים. באמצעות שיטת החשיפה הישירה, ניתן לאפיין את ההשפעות הבקטריוסטטיות או קוטלי החיידקים של ננו-חלקיקים בריכוזים מעכבים מינימליים על ידי קריאות צפיפות אופטית בזמן אמת לאורך זמן. שיטת תרבית ישירה14 מתאימה לבחינת חיידקים הבאים במגע ישיר ועקיף עם משטחים ננו-מבניים. לבסוף, מוצגת שיטת חשיפה ממוקדתמגע 16 לבחינת הפעילות האנטיבקטריאלית של אזור מסוים על משטח ננו-מבני באמצעות יישום ישיר של חיידקים ואפיון גדילת חיידקים בממשק תא-ננו-מבנה. שיטה זו שונה מהתקן התעשייתי היפני JIS Z 2801:200016, והיא מיועדת להתמקד באינטראקציות בין מיקרואורגניזמים לפני השטח ולא לכלול את ההשפעות של פירוק דגימות בתפזורת בתרבית מיקרוביאלית על פעילויות מיקרוביאליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כדי להציג את תרבית משותפת ישירה ושיטות חשיפה ישירה, אנו משתמשים בננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום (nMgO) כחומר מודל להדגמת אינטראקציות חיידקיות. כדי להציג את התרבית הישירה ואת שיטות החשיפה למגע ממוקד, אנו משתמשים בסגסוגת Mg עם משטחים ננו-מובנים כדוגמאות.

1. עיקור ננו-חומרים

הערה: כל הננו-חומרים חייבים לעבור עיקור או חיטוי לפני תרבית מיקרוביאלית. השיטות בהן ניתן להשתמש כוללות חום, לחץ, קרינה וחומרי חיטוי, אך יש לזהות את סבילות החומרים לכל שיטה לפני הניסויים במבחנה .

  1. ננו-חלקיקים
    הערה: ניתן לאחסן דגימות בממס אורגני כגון אתנול או לארוז אותן בכלי או בקופסה ולאחר מכן לבצע עיקור או חיטוי באופן מתאים. הננו-חלקיקים עוקרו בשיטה הבאה להדגמת שיטת התרבית המשותפת הישירה17 ושיטת החשיפה הישירה.
    1. יש לעקר ננו-חלקיקי MgO בתנור הסעה בטמפרטורה של 200°Cלמשך 60 דקות לפני כל ניסוי במבחנה .
      הערה: שיטה זו נבחרה מכיוון שקיטור מים ואור UV עשויים להשפיע על המבנים של ננו-חלקיקי MgO (nMgO)17.
  2. חומרים בתפזורת
    הערה: החומרים הננו-מבניים עוקרו בשיטה הבאה להדגמת שיטת התרבית הישירה.
    1. בשיטת תרבית ישירה14, יש לחטא דגימות ZC21, MG ו-T64 שהוכנו באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV) במשך 4 שעות לפני תחילת המחקרים במבחנה .
    2. בשיטת חשיפה ממוקדת16, יש לחטא את כל הדגימות באמצעות קרינת UV במשך שעתיים לפני תחילת מחקרי המבחנה .
  3. לחלופין, השתמשו באתילן אוקסיד (EtO) לעיקור חומרים רגישים לחום.

2. שיטת תרבות משותפת ישירה (שיטה א')

הערה: בשיטה A, חיידקים בתרבית זריעה בשלב השהיה מעורבבים ישירות עם ננו-חלקיקים בריכוזים מסוימים. לצורך בחינת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים, אנו עוקבים אחר פרוטוקול שתואר על ידי Nguyen et al.17.

  1. אפיון ננו-חלקיקים וננו-מבנים
    הערה: הרכב וצורה של ננו-מבנים מאושרים באמצעות עקיפה של אבקת רנטגן.
    1. מדידת ננו-חלקיקים
      1. שקלו את הננו-חלקיקים במסה של פי 9 מהמסה הרצויה למ"ל כדי להכיל דגימות של 3 מ"ל בטריפליקט. לדוגמה, לשקול 0.2 mg/mL nMgO ב 1.8 מ"ג / מ"ל.
        הערה: זה מבטיח פיזור עקבי של ננו-חלקיקים בתרביות החיידקים ובמרקים.
      2. מדדו את כל הננו-חלקיקים בצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 5.0 מ"ל שנשקל מראש וזפת באמצעות איזון אנליטי.
  2. הכנה וגידול תרביות חיידקים
    1. עבור כל ניסוי במבחנה , אחזר מלאי תאי חיידקים מאחסון ב -80 מעלות צלזיוס. הוסף 10 μL מכל מלאי תאי חיידק לתוך 5 מ"ל של מדיום גידול מתאים.
    2. הכניסו את התווך המחוסן לאינקובטור-שייקר בטמפרטורה של 37°C ו-250 סל"ד למשך כ-16 שעות למשך הלילה.
      1. אם מגדלים מיני סטפילוקוקוס , תת-תרבית על ידי הצבת 400 מיקרוליטר מכל תרבית לילה לתוך 20 מ"ל של מדיום גידול טרי (100 מיקרוליטר/5 מ"ל בינוני) ודגרה עם רעידות ב-37 מעלות צלזיוס ו-250 סל"ד למשך 4-6 שעות נוספות.
  3. שטיפה וספירה של תאי החיידק כדי לקבוע את צפיפות הזריעה
    הערה: צפיפות הזריעה הרצויה של 7.8 × 106 CFU/mL זוהתה כמספר התאים הגדול יותר ממה שנדרש כדי לאשר זיהום בדרכי השתן.
    1. אספו חיידקים בתרבית על ידי הוספת 1 מ"ל מתרבית החיידקים בן הלילה לצינורות מיקרוצנטריפוגות של 1.5 מ"ל. צרו כמות מספקת של אליציטוטים מתרביות חיידקים בן לילה וצנטריפוגו אותם למשך 10 דקות ב-1,956 × גרם כדי להגיע לצפיפויות הזריעה הרצויות.
    2. לאחר הצנטריפוגה, יש להוציא את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים ולהכניס את הסופרנאטנט לכלי קיבול איסוף. להשעות מחדש את כדורי התא ב 0.5 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. שלב שני מתלים של 0.5 מ"ל כדי ליצור 1 מ"ל של השעיה כדי להפחית את מספר 1 מ"ל aliquots של תאים מרחפים לשישה. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות במהירות של 1,956 × גרם.
    3. השלם מחזור שטיפה שני באמצעות מדיום גידול טרי, כמו בשלב 2.3.2, כדי להפחית את מספר 1 מ"ל aliquots של תאים שטופים resuspended לשלושה.
    4. השלימו את המחזור השלישי, כמו בשלב 2.3.2, למעט השעיה מחדש של כדורי התא ב-0.33 מ"ל של מאגר Tris buffer (hydroxymethyl) aminomethane buffer (Tris buffer, pH 8.5). שלב את שלושת המתלים, כל אחד בנפח 0.33 מ"ל, למיקרוצנטריפוגה אחת של 1.5 מ"ל. חזור על הצנטריפוגה במשך 10 דקות במהירות של 1,956 × גרם.
      הערה: מאגר Tris אינו מכיל יוני Mg 2+ או Ca2+ 31. זה חשוב לשימוש בספקטרומטריית פליטת פלזמה-אופטית מצומדת אינדוקטיבית (ICP-OES) למדידת יוני Mg 2+ ו- Ca2+ במרקים שלאחר התרבית. לעומת זאת, הפוספטים הנמצאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS)32, למשל, תופסים יוני Mg 2+ + או Ca2+ 33,34,35 וגורמים לבלבול בפרשנות נתוני ICP-OES.
    5. מוציאים את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים. השהה מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של חיץ טריס טרי, הידוע בשם תרחיף התא - תרבית זריעה חיידקית בשלב ההשהיה.
    6. קבע את ריכוז תרחיף התא (תאים/מ"ל) באמצעות המוציטומטר.
  4. יצירת תרבית החיידקים הזורעים
    הערה: נפח הדגימה הכולל הוא 3 מ"ל והיא הושלמה בטריפליקט (9 מ"ל בסך הכל).
    1. קבע את הנפח הכולל של תרבית זריעת חיידקים הדרושה. כדי ליצור את תרבית הזריעה, השתמש ב- C 1 V1= C 2 V2כדי לחשב את נפח תרחיף התאים הדרוש ליצירת תרבית זריעה של 7.8 × 106 תאים / מ"ל. הוסף את הנפח המחושב של תרחיף התא (V1) לנפח הנדרש של מדיית הגידול (V2).
    2. קבע את צפיפות זריעת החיידקים בפועל ב- CFU/mL. צור דילול טורי פי עשרה ל 10-4. מורחים את הדילול 10-4 על אגר הגידול המתאים ודוגרים למשך הלילה. לאחר הדגירה, לספור את מספר המושבות, ולחשב את CFU/mL.
  5. היווצרות חיידקים ותרביות ננו-חלקיקים
    1. בלוחות פוליסטירן 12 בארות, שאינם מטופלים ברקמות, אליקוט 2 מ"ל של תרבית הזריעה החיידקית בכל באר למספר הבארות הדרושות.
    2. עבור כל צינור מיקרוצנטריפוגה של 5 מ"ל המכיל nMgO שוקל מראש, הוסף 3 מ"ל של תרבית הזריעה החיידקית. מערבלים לזמן קצר כדי לערבב את nMgO עם החיידקים. Aliquot 1 מ"ל של התערובת לשלוש בארות נפרדות כדי ליצור את הדגימות המשולשות של כל משקל שנמדד מראש של nMgO. יש לקפץ את תערובת החיידקים/nMgO 2-3x לפני כל 1 מ"ל aliquot מיוצר כדי לשמור על nMgO בתרחיף.
      הערה: דגימות הבקרה יכללו 3 מ"ל תאים בלבד, 3 מ"ל מדיה בלבד ו-3 מ"ל המכילים את הריכוזים הנמוכים והגבוהים ביותר של ננו-חלקיקים בשימוש. אלה מוכנים כמו בשלב 2.5.2. כל דגימות הבקרה הושלמו בשלשה.
    3. לדגור על כל לוחות 12 בארות ב 37 ° C ו 120 סל"ד במשך 24 שעות.
  6. קביעת צמיחת תאי החיידק לאחר חשיפה ל- nMgO
    1. לאחר דגירה לילית של תרביות חיידקים, לאסוף כל דגימה 3 מ"ל על ידי pipeting לתוך צינור חרוטי בודד 15 מ"ל.
    2. השתמש בלוח של 96 בארות כדי ליצור דילולים טוריים ביחס של 1:10. לקבוע את מספר העמודות הדרושות כדי לדלל באופן סדרתי את כל הדגימות המכילות חיידקים. הוסף 180 μL של מאגר Tris לכל באר בשורה B לשורה G עבור מספר העמודות המתאים.
    3. מערבול קצר כל צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל דגימות חיידקים, ולהוסיף 50 μL לבאר בודדת בשורה A.
    4. עבור כל באר בשורה A, העבירו 20 μL לשורה B (למשל, A1 עד B1), וערבבו לזמן קצר על ידי פיפטינג לקבלת נפח של 200 μL. בעזרת קצה צינור סטרילי, העבירו 20 μL מהבאר בשורה B לבאר בשורה C. המשיכו בתבנית זו עד שהבאר בשורה G מכילה 200 μL, השלמת דילול סדרתי מ-10-1 בשורה B ל-10-6 בשורה G.
    5. יש למרוח 100 מיקרוליטר מכל באר על צלחת אגר גדילה מתאימה ולפזר על הצלחת כדי לפזר את תרבית התא. הכניסו את הצלחות לשייקר אינקובטור למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 24 שעות.
    6. בדוק את הצלחות וספור את אלה שיש להם כ 25-300 מושבות. במידת האפשר, בחר צלחות באותו ערך דילול. השתמש במספר המושבות בכל צלחת כדי לחשב את CFU/mL.
  7. הערכת רמת החומציות שלאחר הדגירה
    הערה: בצע את הוראות היצרן עבור כל דגם מד pH.
    1. כיול מראש של מד pH באמצעות פתרונות סטנדרטיזציה של pH 4, pH 7 ו- pH 10. קרא כל דגימת חיידקים על ידי הצבת בדיקת ה- pH בצינור החרוטי של 15 מ"ל.
  8. הכנת דוגמאות עבור ICP-OES
    הערה: ICP-OES משמש לקביעת הריכוז של יוני Mg 2+ ו- Ca2+. קטיונים אלה נחשבים חשובים, שכן כל אחד מהם משתתף בחילוף החומרים התאי.
    1. צנטריפוגה כל צינור חרוטי בנפח 15 מ"ל שהוכנה בשלב 2.6.1 למשך 5 דקות במהירות של 5,724 × גרם כדי להשליך את פסולת התא והננו-חלקיקים.
    2. באמצעות צינור חרוטי של 15 מ"ל, מדללים 30 מיקרוליטר של הסופרנאטנט ל-2.97 מ"ל של 18.2 Ω מים מסוננים ליצירת דילול של 1:100.
      הערה: ניתן לכוונן את מקדם הדילול בהתבסס על ריכוזי היונים המוקרנים ומגבלת הגילוי של מכשיר הספקטרומטר.
    3. קרא את הדוגמאות באמצעות ICP-OES.

3. שיטת חשיפה ישירה (שיטה ב')

הערה: אם קצב הגידול של החיידקים שנבחרו אינו ידוע, יש להשלים סטנדרטיזציה של עקומת הצמיחה לפני יישום שיטה זו.

  1. קבע את הפעילות הבקטריוסטטית והחיידקית בזמן אמת בעת חשיפה לננו-חלקיקים המעניינים.
    1. הכן את הריכוזים הרצויים של ננו-חלקיקים באמצעות השיטות המתוארות בשלב 2.1-2.1.2.2. הכינו שתי קבוצות של כל משקל של ננו-חלקיקים שישמשו: האחת תתווסף ל-3 מ"ל אליציטוטים של תרבית חיידקים בשלב הגידול הלוגריתמי, והשנייה תתווסף ל-3 מ"ל אליציטוטים של מדיום גידול ללא חיידקים כקבוצות ביקורת.
    2. לקבוע את האנטיביוטיקה הבקטריוסטטית וקוטלת החיידקים המתאימה למיני החיידקים שייבדקו.
      הערה: נדרש ידע על הריכוז המעכב המינימלי עבור כל אנטיביוטיקה.
  2. חשב את הנפח הכולל של תרבית חיידקים הדרוש לדגימות משולשות של 3 מ"ל עבור כל דגימות הננו-חלקיקים, האנטיביוטיקה והביקורת.
    הערה: נדרש נפח שווה של מדיום גידול סטרילי. אם השימוש בספקטרופוטומטריה מתוכנן, הדבר דורש לבצע התאמות לנפח הכולל הדרוש ללינה של נפח 0.5 מ"ל עד 1.0 מ"ל הדרוש לקוביות.
  3. יום 1: עבור כל ניסוי במבחנה, צור מניות לילה לאחר שלב 2.2.1-2.2.2.
  4. יום 2: ודא שהגדרות קורא הלוחות יכולות להכיל צלחת של 96 בארות עם צפיפות אופטית של 600 ננומטר. למדוד את הדגימות ב 200 μL aliquots באמצעות צלחת 96 באר.
    1. לקבוע תרבית חיידקים ראשונית OD600 ב 0.01 - הצפיפות המשמשת לתחילת תקופת הדגירה הראשונית לפני הוספת ננו-חלקיקים ואנטיביוטיקה.
    2. אספו את תרבית החיידקים למשך הלילה מהאינקובטור-שייקר.
      1. עבור כל חומר (למשל, ננו-חלקיקים שנמדדו מראש או אנטיביוטיקה) שיש לבדוק, יש ליצור תרבית חיידקים נפרדת ב-OD600 של 0.01. השתמש במיכל גדול מספיק כדי להכיל את נפח תרבית התאים הדרוש (למשל, בקבוק Erlenmeyer מעוקר או צינורות חרוטי 50 מ"ל).
      2. יש לדלל את דגימות החיידקים במהלך הלילה עם מדיום גידול על ידי הצבת שלוש אליציטוטים של 200 μL של מדיום הגידול בשלוש בארות ושלושה אליציטוטים של 200 μL של תרבית החיידקים לתוך בארות נוספות (למשל, A1 עד A6).
      3. הכניסו את הצלחת בעלת 96 הבארות לקורא הלוחות וסרקו אותה.
        הערה: הקריאות ממוצעות עבור כל באר סרוקה כדי להפיק ערך ממוצע.
      4. כדי לחשב את צפיפות החיידקים בתרחיף, ממוצע הערך הממוצע עבור כל באר המכילה דגימה משולשת.
      5. כדי לקבוע את הצפיפות האופטית של החיידקים, הפחיתו את ממוצע דגימת המרק מהממוצע החיידקי.
      6. אם יש צורך להמשיך לכוונן את התרחיף החיידקי, המשיכו להוסיף ציר או תרבית חיידקים למשך הלילה לפי הצורך, וחזרו על הסריקה בקורא הצלחות לפי הצורך עד לקבלת OD600 של כ-0.01.
      7. דוגרים ב-37°C עם רעידות ב-150 סל"ד עד שמגיעים לצמיחה לוגריתמית.
  5. מוציאים את תרביות החיידקים משייקר האינקובטור.
    1. Aliquot 3 מ"ל של תרבית חיידקים OD600 0.01 לתוך מסומן 15 מ"ל צינורות חרוטי עבור דגימות בדיקה ובקרה משולש.
    2. Aliquot 200 μL של תרבית חיידקים לתוך שלוש בארות של צלחת 96 בארות ולמדוד את הדגימות באמצעות קורא הלוחות.
    3. חשב את הקריאות כמתואר קודם לכן בשלב 3.4.2.2 ובשלב 3.4.2.6 - "-0.5 שעות קריאה".
  6. יצירה ומדידה של תערובות חיידקים/ננו-חלקיקים
    1. Aliquot 3 מ"ל של מדיום גידול סטרילי במספרים שווים לתרביות החיידקים לתוך צינורות חרוטיים מסומנים 15 מ"ל עבור דגימות ביקורת (במשולש).
    2. כדי להכין תרחיפים של חיידקים/ננו-חלקיקים ותרחיפים סטריליים של מדיה/ננו-חלקיקים, יש להסיר 1 מ"ל של תרבית חיידקים או מדיום מכל קבוצה משולשת של צינורות חרוטיים בנפח 15 מ"ל.
      1. מניחים את האליציטוטים של 1 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה של 5 מ"ל המכיל ננו-חלקיקים שנמדדו מראש, ומערבלים לזמן קצר כדי לערבב.
      2. מצינור הצנטריפוגה של 5 מ"ל, החזירו אליציטוטים של 1 מ"ל של החיידקים/ננו-חלקיקים או מתלים בינוניים/ננו-חלקיקים לצינור החרוטי של 15 מ"ל כדי לפזר את הננו-חלקיקים בצורה הומוגנית.
        הערה: פיפט את תערובת החיידקים/ננו-חלקיקים 2x-3x לפני כל aliquot 1 מ"ל הוא pipeted כדי לשמור על ננו-חלקיקים בהשעיה.
  7. יצירה ומדידה של תערובות חיידקים/אנטיביוטיקה
    1. כדי ליצור את תרביות החיידקים/אנטיביוטיקה, aliquot 3 מ"ל של תרבית חיידקי מודגר לתוך מסומן בהתאמה 15 מ"ל צינורות חרוטיים.
    2. לאחר שכל הדגימות הוכנו, aliquot 200 μL של כל דגימה לתוך בארות בודדות של צלחת 96 בארות.
    3. הכניסו את הלוחות לקורא הלוחות, והתחילו סריקה - קריאת "0 שעות".
    4. מניחים את צינורות החרוט 15 מ"ל המכילים את הדגימות לתוך אינקובטור-שייקר ב 37 ° C ו 150 סל"ד. רשום את כל הנתונים כפי שתוארו קודם לכן בשלב 3.4.2.2 ובשלב 3.4.2.6.
  8. כ-15 דקות לאחר השלמת הקריאה של 0 שעות, חזור על השלבים המתוארים בשלב 3.7.2-3.7.3-הקריאה "0.5 שעות".
    1. לאחר 0 שעות שנקבעו, חזור על השלבים המתוארים בשלב 3.7.2-שלב 3.7.3 כל 90 דקות במשך שישה מחזורים; השלם תוך 9 שעות.
    2. לאחר השלמת המחזור השישי, הניחו את הדגימות באינקובטור-שייקר למשך 15 שעות נוספות ב 37 מעלות צלזיוס ו -150 סל"ד. חזור על השלבים המתוארים בשלב 3.7.2-3.7.3 כדי להשיג את הקריאה של 24 שעות. רשום את כל הנתונים כפי שתוארו קודם לכן בשלב 3.4.2.2 ובשלב 3.4.2.6.

4. שיטת תרבית ישירה (שיטה C)

הערה: בשיטה C, חיידקים בתרבית זריעה בשלב השהיה ממוקמים ישירות על המשטחים הננו-מבניים המעניינים. לצורך בחינת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של ננו-מבנה, אנו עוקבים אחר פרוטוקול שתואר על-ידי Zhang et al.14. כדי להדגים שיטת תרבית ישירה זו, ZC21 (סגסוגת Mg-Zn-Ca) וסיכות Mg שימשו כדגימות.

  1. הכנת וגידול תרביות החיידקים
    1. עבור כל ניסוי במבחנה, צור מניות לילה לאחר שלב 2.2.1-2.2.2.
  2. שטיפה וספירת החיידקים כדי לקבוע את צפיפות הזריעה
    הערה: צפיפות הזריעה הרצויה של 7.5 × 105 CFU / מ"ל זוהתה כריכוז התאים המדווח הגורם לזיהומים אורתופדיים14.
    1. שלפו את תרבית החיידקים בן הלילה מהאינקובטור-שייקר.
    2. שטפו ואספו את החיידקים, לאחר שלב 2.3.2-2.3.2.3, אך החליפו את המדיום הטרי בנוזל גוף מדומה מתוקן (rSBF) עבור כל שלב כביסה.
      הערה: rSBF הוא פתרון חיץ המחקה את הריכוז היוני של פלסמת דם אנושית. עם זאת, rSBF מכיל רק תרכובות אנאורגניות, והוא ללא תרכובות ביואורגניות כגון חלבונים. על מנת לפתור זאת, סרום בקר עוברי (FBS) משולב עם rSBF כדי לדמות את הרכב הדם האנושי כדי לחקות טוב יותר את היווצרות טבעית של אפטיט ברקמות מסוידות בתנאי ניסוי36.
    3. מוציאים את הסופרנאטנט מהתאים הכדוריים. להשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של rSBF בתוספת 10% FBS - השעיית התא.
    4. קבע את ריכוז תרחיף התא (תאים/מ"ל) באמצעות המוציטומטר. לדלל את תרחיף התא לריכוז של 7.5 × 105 תאים / מ"ל ב rSBF בתוספת 10% FBS. צור תרבות זריעה לאחר שלב 2.4.1.
    5. קבע את צפיפות הזריעה בפועל לאחר שלב 2.4.2.
  3. מפזרים תרחיף תאי חיידקים על הדגימות בבארות התרבית.
    1. הניחו הן את הדגימות והן את דגימות הבקרה בבארות הבודדות של צלחת פוליסטירן בת 48 בארות, שאינה מטופלת ברקמות.
    2. Aliquot 0.75 מ"ל של תרחיף התא לתוך כל באר המכילה את הדגימות ואת הפקדים. הכניסו את 48 הבארות לשייקר אינקובטור למשך 24 שעות ב-37°C עם טלטול ב-120 סל"ד.
  4. אפיון ריכוז החיידקים
    1. לאחר 24 שעות של דגירה, אספו את הדגימות והניחו אותן בצינורות איסוף נפרדים מסומנים.
    2. אספו שתי דגימות מכל קבוצה והכניסו אותן בנפרד לצינורות מיקרוצנטריפוגות מסומנות של 5.0 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של rSBF לכל צינור.
    3. הכניסו את הדגימות שנאספו בשלב 4.4.2 לאמבט סוניקציה, ובצעו סוניקציה למשך 10 דקות. לאחר כל פרק זמן של 5 דקות, מערבלים כל דגימה במשך 5 שניות.
    4. אספו את ה-rSBF המכיל את תאי החיידקים החדשים שנותקו והכניסו את התרחיף לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי ומסומן.
  5. דילולים סדרתיים וציפוי החיידקים
    1. יש לדלל באופן סדרתי את תרחיף החיידקים לאחר שלב 2.6.2-2.6.6.
  6. הערך את רמת החומציות שלאחר הדגירה של מדיה תרבותית על ידי ביצוע שלב 2.7.
  7. הכן את המדיום שלאחר התרבית עבור ICP-OES על-ידי ביצוע השיטות המתוארות בשלב 2.8.

5. שיטת חשיפה למגע ממוקד (שיטה D)

הערה: בשיטה D, חיידקים על נייר מסנן ניטרוצלולוז נמצאים במגע ישיר עם אזור עניין על המשטחים הננו-מבניים. שיטה זו ממזערת את ההפרעה של פירוק דגימות בתפזורת בתרביות חיידקים עם פעילויות החיידקים. כדי לבחון פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-פני שטח, אנו עוקבים אחר פרוטוקול שתואר על-ידי לין ועמיתיו 16.

  1. בצע את ההליכים בשלב 2.2.1-2.2.2.1 כדי ליצור תרבית זריעה חיידקית. אשר את צפיפות הזריעה בפועל לאחר שלב 2.4.2.
  2. מכינים את הדגימות לגודל של 1 × 1 ס"מ2 בצורה מרובעת. הכינו את כל סוגי הדגימות בשלשה. במידת הצורך, הניחו את הדגימות על מחזיק תלת מימדי (3D) בקוטר 15 מ"מ על 10 מ"מ גובה. מניחים את הדגימה והמחזיק בבאר של צלחת באר פוליסטירן שאינה מטופלת בתרבית רקמה.
  3. הכינו ניירות ניטרוצלולוז מעוקרים על ידי חיתוך כל אחד לקוטר של 1 ס"מ. מניחים את ניירות הניטרוצלולוז המוכנים על צלחת אגר המכילה את המדיום המתאים.
  4. פיפט 50 μL של תרבית חיידקים מדוללת על נייר המסנן.
  5. פיפט 50 μL של תווך מתאים למרכז כל משטח דגימה.
  6. בעזרת פינצטה מעוקרת, להרים את נייר nitrocellulose מפני השטח של אגר. הפוך בזהירות את נייר הניטרוצלולוז והנח אותו על משטח הדגימה כך שהחיידקים יהיו במגע עם 50 μL של התווך והמשטח הננו-מבני של עניין.
  7. הוסף 1 מ"ל של חיץ Tris לכל באר המכילה דגימה כדי לשמור על הלחות. לדגור את צלחת באר פוליסטירן המכיל את כל הדגימות ב 37 ° C במשך 24 שעות.
  8. אסוף את נייר הניטרוצלולוז מכל משטח דגימה. הכניסו כל אחד מהם ל-5 מ"ל של מאגר Tris. מערבול את ניירות הסינון שנאספו ודגימות חומר ננו-משטח במשך 5 שניות.
  9. בצעו סוניזציה של כל דגימה למשך 10 דקות. מערבולת במשך 5 שניות אחרי 5 דקות ושוב אחרי 10 דקות.
  10. אספו את מתלי החיץ של Tris מכל הדגימות והכניסו כל נפח לשפופרות איסוף טריות נפרדות.
  11. לדלל באופן סדרתי ולצלחת את הדגימות לאחר שלב 2.6.2-2.6.6.

6. אפיון פוסט-תרבית של חיידקים וננו-חומרים

  1. בחינת הידבקות חיידקים ומורפולוגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
    1. לאחר דגירה של לילה, יש להוסיף 10% גלוטראלדהיד לכל באר של צלחת פוליסטירן בת 48 בארות שאינה מטופלת ברקמות, עד שהדגימות יכוסו במלואן. דגרו על הדגימות במשך שעה אחת כדי לתקן את תאי החיידקים.
    2. שאפו את הגלוטאראלדהיד לתוך בקבוק פסולת ושטפו את כל הדגימות 3x עם תמיסת חיץ Tris כדי להסיר חיידקים שאינם נדבקים.
    3. יש לייבש את הדגימות באמצעות 30%, 75% ו-100% אתנול למשך 30 דקות כלאחת 16.
      הערה: מומלץ להשתמש במייבש נקודה קריטית כדי לייבש את הדגימות. זה לא אידיאלי לייבש את הדגימות באוויר בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות.
    4. השתמש בסרטי הדבקה מוליכים, כגון סרטי נחושת או פחמן, כדי לקבע את הדגימות על גבי ספח SEM. צפו את משטחי הדגימה באמצעות ציפוי מרזב כדי לספק מוליכות לפני ההדמיה (למשל, צפו צלחות Mg עם חיידקים דבוקים תחת פלטינה/פלדיום (Pt/Pd) למשך 45 שניות ב-20 mA16).
      הערה: חומרי הציפוי, זמן העיבוד וזרם הפעולה עשויים להשתנות בהתאם לסוגי הדגימה.
    5. צלם תמונות של החיידקים על הדגימות באמצעות SEM עם מרחק עבודה מתאים ומתח מואץ ובהגדלות הרצויות. לדוגמה, השתמש ב- SEM עם גלאי אלקטרונים משני כדי לצלם תמונות במרחק עבודה של 5 מ"מ ומתח האצה של 10 kV16.
  2. לבחון מורפולוגיה של פני השטח של דגימות ננו-חומרים פוסט-תרביות באמצעות SEM.
    1. עבור ננו-חומרים, שטפו את הדגימות באמצעות Tris buffer 3x כדי להסיר את החיידקים החופשיים שאינם מחוברים לדגימה. עבור ננו-חלקיקים, פזרו את החלקיקים לממס שאינו משפיע על תכונות הדגימה באמצעות אולטרה-סוניקציה כדי להשיג פיזור טוב יותר בעת הצורך.
    2. יבשו את הדגימות לאחר הליך הכביסה.
    3. השתמש בסרטי הדבקה דו-צדדיים מפחמן או נחושת כדי להדביק את הדגימות על גבי ה-SEM.
    4. צור שכבת משטח מוליכה של Pt/Pd באמצעות ציפוי מרזב, כמתואר בשלב 6.1.4, לפני ההדמיה. צלם את התמונות לדוגמה כמתואר בשלב 6.1.5.
    5. נתח את הרכב יסודות פני השטח באמצעות EDS עם מתח האצה מתאים ובהגדלות הרצויות (למשל, ב- 10 kV לאחר ביצוע ניתוח SEM16).
  3. הדמיה פלואורסצנטית של הידבקות חיידקים
    1. הכינו את הדגימות להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי שטיפתן תחילה עם Tris buffer 3x. ייבשו את הדגימות באוויר בטמפרטורת החדר.
    2. צבעו כל דגימה בצבע פלואורסצנטי מסוג T של תיאופלבין במינון 10 מיקרומטר בהתאם לפרוטוקול37 שנקבע.
    3. בצע הדמיה פלואורסצנטית של הידבקות חיידקים באמצעות מיקרוסקופ הפוך בשילוב עם מצלמה דיגיטלית של מכשיר מצמיד מטען מכפיל אלקטרונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זיהוי הפעילות האנטיבקטריאלית של חלקיקי תחמוצת מגנזיום ומשטחים ננו-מבניים הוצג באמצעות ארבע שיטות במבחנה הישימות על פני סוגי חומרים ומינים מיקרוביאליים שונים.

שיטה א' ושיטה ב' בוחנות את פעילות החיידקים כאשר הם נחשפים לננו-חלקיקים בשלב השהיה (שיטה א') ובשלב לוג (שיטה ב') למשך 24 שעות או יותר. שיטה א' מספקת תוצאות לגבי מיקרופון ו-MBC, בעוד ששיטה ב' קובעת את ההשפעות המעכבות לעומת החיידקיות של ננו-חלקיקים. שיטה C בוחנת את פעילות החיידקים במגע ישיר ועקיף עם משטחים ננו-מבניים, ושיטה D בוחנת את הפעילות החיידקית על אזור נבחר בממשק תא-ננו-מבנה למשך 24 שעות או יותר.

השיטות שבהן נעשה שימוש מתוארות באיור 1 ובאיור 2, ותוצאותיהן מוצגות באיור 3, איור 4, איור 5, איור 6, איור 7 ואיור 8. תוצאות ניסוי מייצגות שמכמתות פעילות אנטי-מיקרוביאלית של nMgO כנגד חיידקים ושמרים גראם-שליליים וגראם-חיוביים ניתן לראות באיור 3. ניתן לראות את הפעילויות האנטי-בקטריאליות של nMgO ו-nMg(OH)2 כנגד MRSA באיור 4. ניתן לראות את הפעילות האנטי-בקטריאלית של משטחים ננו-מבניים כנגד MRSA באיור 5 ובאיור 6. לבסוף, ניתן לראות את הפעילות האנטי-בקטריאלית של סגסוגות מגנזיום נגד E. coli באיור 8B.

באמצעות שיטה A, ניתן לקבוע את MICs ו- MBCs עבור חיידקים שנחשפו לננו-חלקיקים באמצעות שיטות וחומרים עקביים. עקביות זו מאפשרת לערוך השוואות בין מינים באמצעות MBCs שזוהו כדי לקבוע את הריכוז החזק ביותר של ננו-חלקיקים שנבדקו. בנוסף, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סיווגים אחרים של מיקרואורגניזמים להשוואות של MICs וריכוזים קטלניים מינימליים (MLCs17) גם כן. כאן, ננו-חלקיקים מעוקרים נמדדו מראש בכמות המאפשרת טריפליקטים של כל ריכוז נדרש. ננו-חלקיקים אלה הושעו בתרבית זריעה חד-חיידקית בשלב השהיה בצפיפות של 6 × 10, 6-8 × 10,6 תאים/מ"ל. השיטה שתוארה להשהיית הננו-חלקיקים שנמדדו מראש באמצעות תרבית זריעה או מרק יצרה בהצלחה דגימות משולשות שהיו הומולוגיות יחסית בפיזור ננו-חלקיקים, מה שעשוי להפחית את הסטייה ב-CFU/mL בתוך דגימות משולשות. תהליך העבודה הניסיוני עבור שיטה זו מומחש באיור 1A. הדגמה של ההשפעות האנטי-מיקרוביאליות של nMgO על חיידקים גראם-שליליים וגראם-חיוביים וקנדידה spp. באמצעות שיטה A ניתן לראות באיור 3. כאן, מיקרופון של 1.0 מ"ג/מ"ל nMgO עבור Escherichia coli ו-Pseudomonas aeruginosa, כמו גם MBC 99.99 של 1.0 מ"ג/מ"ל ו-1.6 מ"ג/מ"ל nMgO, בהתאמה, זוהו עבור המינים האלה (איור 3A). S. epidermidis, S. aureus ו-MRSA חיוביים הדגימו MICs של 0.5 מ"ג/מ"ל, 0.7 מ"ג/מ"ל ו-1.0 מ"ג/מ"ל nMgO, בהתאמה. ערכי MBC 99.99 של 1.6 מ"ג/מ"ל ו-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO זוהו עבור S. epidermidis ו-S. aureus, בהתאמה, בעוד MRSA לא הופחת מעבר ל-MBC90 (איור 3B). בקנדידה spp., C. albicans ו-C. albicans FR, זוהו MICs של 1.2 מ"ג/מ"ל ו-1.0 מ"ג/מ"ל nMgO, בהתאמה. לעומת זאת, nMgO הדגים ערכי MIC של 1.0 ו-0.7 מ"ג/מ"ל עבור C. glabrata ו-C. glabrata ER, בהתאמה. בנוסף, כל מין קנדידה הגיע ל-MBC 90 של 0.7-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO, אבל רק C.glabrata ER הופחת ל-MBC 99.99 ב-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO (איור 3C). בנוסף, ברוב המינים שנבדקו, נקבע זיהוי הריכוז החזק ביותר (MPC) של nMgO. MPC מציין את ריכוז הננו-חלקיקים היעיל ביותר בקרב קהילות רב-מיקרוביאליות17.

שיטה B חושפת חיידקים בשלב הגידול הלוגריתמי לננו-חלקיקים בריכוזים מסוימים כדי לקבוע אם הננו-חלקיקים הם בקטריוסטטיים (מעכבים) או קוטלי חיידקים באמצעות MBCs שזוהו בשיטה A. שיטה זו משתמשת במדידות ספקטרופוטומטריה (OD600) על פני פרקי זמן בדידים כדי לזהות שינויים בצמיחת חיידקים בתגובה לחשיפה לננו-חלקיקים. בנוסף, חיידקים שנחשפו לאנטיביוטיקה בקטריוסטטית או קוטלת חיידקים גדלים במקביל עם חיידקים שנחשפו לננו-חלקיקים בבארות נפרדות כדי לספק התייחסות בזיהוי פעילויות ננו-חלקיקים אלה. הריכוזים של nMgO ו-nMg(OH)2 שבהם נעשה שימוש נגזרו ממחקר קודם שהשתמש בחיידקים בשלב הגדילה הלוגריתמי שנחשפו ל-nMgO ול-nMg(OH)2. ריכוזים של nMgO ו-nMg(OH)2 זוהו באמצעות מקבילות mM שנעו בין 5 mM ל-50 mM. התוצאות הראו כי nMgO היה קוטל חיידקים ל-MRSA ב-30 מילימטר (1.2 מ"ג/מ"ל nMgO), בעוד ש-nMg(OH)2 היה בקטריוסטטי ב-50 מילימטר (2.9 מ"ג/מ"ל nMg(OH)2). ריכוזי האנטיביוטיקה שבהם נעשה שימוש זוהו מהספרות ואושרו בניסויים שלנו. תהליך העבודה הניסיוני עבור שיטה זו מומחש באיור 1B. תוצאות מייצגות עבור שיטה B ניתן לראות באיור 4. כאן, MRSA שלא נחשף לננו-חלקיקים גדל באופן אקספוננציאלי ל-OD600 של 0.85. כאשר נחשפו ל-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO ו-6.25 מיקרוגרם/מ"ל טרימטופריים, צמיחת החיידקים הופחתה ל-OD600 של 0.18 (80.2% ו-81.6%, בהתאמה), ו-2.9 מ"ג/מ"ל nMg(OH)2 הפחיתו את צמיחת החיידקים ל-OD 600 של 0.25 (70.3%). חשיפה לוונקומיצין של 1.0 מיקרוליטר/מ"ל הביאה לירידה של 99.99% בגדילה של MRSA, מה שמרמז על כך שהריכוזים של nMgO ו-nMg(OH)2 ששימשו כאן היו בקטריוסטטיים בפעילותם.

שיטה C בוחנת את הפעילות האנטיבקטריאלית של משטחים ננו-מבניים. תרבית חיידקים בשלב הגדילה בפיגור נזרעה ישירות על משטח ננו-מבני כדי למדוד CFUs עם או בלי מגע ישיר עם פני השטח. באמצעות שיטה זו ניתן היה לקבוע את השפעות פני השטח על הידבקות חיידקים וכדאיות בתנאי מגע ישיר. חיידקים הנמצאים במגע ישיר עם המשטחים הננו-מבניים ובמגע עקיף (בתרחיף תרבית) נאספו וכומתו ב-CFU/mL כדי לקבוע את צמיחת החיידקים בכל תנאי. נתונים אלה המתקבלים עשויים להיות שימושיים ביישומים במורד הזרם של חומרים ננו-מבניים על משטחים לשימוש קליני, שם נדרשת הפחתה בהתיישבות חיידקים על מבני פני השטח. תהליך העבודה הניסיוני עבור שיטה זו מומחש באיור 2A. תוצאות מייצגות עבור שיטה C ניתן לראות באיור 5. כאן, לא היה עיכוב של צמיחת חיידקים עם מגע עקיף. עם זאת, הידבקות חיידקים הופחתה עבור כל המצעים, באופן המשמעותי ביותר עם סגסוגת ZC21, ואחריה T64 (טיטניום), מגנזיום, זכוכית בלבד, וסגסוגת ZSr41, בהתאמה. תוצאות אלה מצביעות על כך של-ZC21 הייתה הפעילות האנטיבקטריאלית החזקה ביותר נגד הידבקות וצמיחה של MRSA עבור כל הדגימות שנבדקו14.

שיטה D בוחנת פעילות אנטיבקטריאלית באזור עניין נבחר בממשק תא-ננו-מבנה באמצעות מיקום ישיר של חיידקים בנייר סינון על משטח ננו-מבני. באמצעות שיטה זוניתן לזהות מתאם בין פעילות אנטיבקטריאלית לבין תכונות פני השטח, כגון כימיית פני השטח, חספוס ושטח פני השטח הננו-מבניים. זרימת העבודה הניסיונית עבור שיטה זו מודגמת באיור 2B. תוצאות מייצגות עבור שיטה D ניתן לראות באיור 6. כאן, לא זוהה S. aureus בר קיימא על דגימות 1.9A, 1.9 AA ו- EPD או ניירות הסינון הזוגיים שלהם. עם זאת, חשיפה לדגימות EPD לאחר חישול (A-EPD) הפחיתה את צמיחת החיידקים למספר תאים על פני השטח הננו-מובנים ונייר הסינון המשויך. גם בדגימה שהכילה מגנזיום (Mg) לא הייתה צמיחת חיידקים, אך חיידקים בני קיימא בודדו מנייר הסינון המשויך. ירידה בגדילה של S. aureus לא נצפתה בדגימות הטיטניום והזכוכית או בניירות הסינון הזוגיים שלהם16.

בנוסף לשימוש בשיטות שתוארו לעיל כדי לקבוע פעילויות מיקרוביאליות, ניתן להשתמש במיקרוסקופ SEM ופלואורסצנטיות כדי לאפיין את השינויים המורפולוגיים המתרחשים במיקרואורגניזמים לאחר חשיפה לננו-חלקיקים וחומרים ננו-מבניים. תמונות SEM המייצגות המציגות את Escherichia coli לאחר חשיפה מוצגות באיור 7A, ואלה המציגות את S. aureus הגראם-חיובי לאחר החשיפה מוצגות באיור 7B. באמצעות טכניקת הדמיה SEM עם הגדלה של 5,000x, ניתן לזהות שינויים פנוטיפיים ב- E. coli שנחשפו לריכוזים של 0.5 mg/mL nMgO ומעלה17. ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי גם כדי לאפיין שינויים מורפולוגיים במיקרואורגניזמים, אך עם עלויות נמוכות יותר ונגישות רבה יותר מאשר SEM. איור 8 מראה תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של E. coli שנחשף לחומר הננו-מבני MgY_O במשך יום, יומיים ושלושה ימים, וכן התייחסות ל-E. coli. רק מין חיידק אחד, E. coli, היה בשימוש בתחילה. בעתיד נשקול לחשוף זני חיידקים נוספים לאותם חומרים מעניינים כדי לייצר הבנה מקיפה יותר של תגובות חיידקים לחשיפה MgY_O. בתוצאות אלה, ניתן היה לצפות ולצלם תאי E. coli בודדים ומושבות באמצעות צביעת תיאופלבין T ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לניתוח איכותי של הפעילות האנטיבקטריאלית של MgY_O15.

Figure 1
איור 1: דיאגרמות סכמטיות לקביעת מיקרו-חלקיקים MIC או MBC90-99.99 ופעילויות בקטריוסטטיות או קוטלי חיידקים בתרביות תאים לאחר חשיפה . (A) שיטת תרבית משותפת ישירה17. (B) שיטת חשיפה ישירה. קיצורים: CFU = יחידות יוצרות מושבה; NPs = ננו-חלקיקים; OD600 = צפיפות אופטית ב- 600 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: דיאגרמות סכמטיות לקביעת גדילת חיידקים במגע ישיר ועקיף ובממשק תא-ננו-מבנה של משטחים ננו-מבניים. (א) שיטת תרבות ישירה14. (ב) שיטת חשיפה ממוקדת16. קיצורים: CFU = יחידות יוצרות מושבה; SEM = מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ייצוג של חיידקים ושמרים בני קיימא שכומת על-ידי CFU/mL 24 שעות לאחר חשיפה ל-0-2.0 מ"ג/מ"ל nMgO. (A) CFU/מ"ל של חיידקים גראם-שליליים, כולל E. coli ו-P. aeruginosa. (B) CFU/מ"ל של חיידקים גראם-חיוביים, כולל S. epidermidis, S. aureus ו-S. aureus עמיד למתיצילין. (C) CFU/מ"ל של C. albicans רגיש לתרופות, C. albicans FR עמיד לתרופות, C. glabrata רגיש לתרופות, ו-C. glabrata ER עמיד לתרופות.הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן (N = 9). *p ≤ 0.05, נמוך משמעותית מהקבוצות עם 0-0.7 מ"ג/מ"ל nMgO עבור החיידק או השמרים המתאימים. ^p ≤ 0.05, נמוך משמעותית מהקבוצות עם 0-1 מ"ג/מ"ל nMgO עבור המיקרואורגניזם המתאים. #p ≤ 0.05, נמוך משמעותית מהקבוצות ב 0-0.5 מ"ג / מ"ל nMgO עבור המיקרואורגניזם בהתאמה. &p ≤ 0.05, נמוך משמעותית מהקבוצות ב 0-0.3 מ"ג / מ"ל nMgO עבור מיקרואורגניזם בהתאמה17. נתון זה שונה מ Nguyen et al.17. קיצורים: FR = עמיד בפני פלוקונזול; ER = עמיד בפני echinocandin; nMgO = ננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום; CFU = יחידות יוצרות מושבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ייצוג של קריאות צפיפות אופטית (OD600) שצולמו בזמן אמת עבור S. aureus עמיד למתיצילין. חשיפה ל-MRSA ל-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO, 2.9 מ"ג/מ"ל nMg(OH)2, 6.25 מיקרוגרם/מ"ל טרימטופריים ו-1.0 מיקרוגרם/מ"ל ונקומיצין במשך 24 שעות. p ≤ 0.025: הגידול של MRSA שנחשף לוונקומיצין של 1.0 מיקרוגרם/מ"ל ב-0.5 שעות נמוך משמעותית מהגידול של MRSA שנחשף ל-2.9 מ"ג/מ"ל Mg(OH)2 ב-7.5 שעות. ^p ≤ 0.025: הגידול של MRSA שנחשף לוונקומיצין של 1.0 מיקרוגרם/מ"ל ב-24 שעות לאחר החיסון נמוך משמעותית מהגידול של MRSA שנחשף ל-2.9 מ"ג/מ"ל מ"ג(OH)2 לאחר 24 שעות. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ייצוג של S. aureus עמיד למתיצילין שכומת על-ידי CFU/mL 24 שעות לאחר חשיפה לדגימות ולבקרות. חיידקים נזרעו בצפיפות ממשית של 7.5 × 105 תאים/מ"ל ואושרו על ידי CFU/מ"ל. הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן, n = 3; *P < 0.05. Equation 1p < 0.05 בהשוואה ל-CFU בדגימות ZC21. נתון זה שונה מג'אנג ואחרים 14. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כימות מייצג על-ידי CFU/mL של צפיפות הזריעה של חיידקים 24 שעות לאחר חשיפה לדגימות Mg שטופלו על פני השטח של 1.9 A, 1.9 AA, EPD ו-A-EPD, ודגימות בקרה של Mg ו-Ti. חיידקים נזרעו בצפיפות ממשית של 6 × 106 CFU/mL, כפי שמיוצג על ידי הקו המקווקו האדום. הנתונים מיוצגים כממוצע ± סטיית תקן; n = 3. *P < 0.05. הקו השחור המוצק מציין את תוצאות הניתוח הסטטיסטי של צפיפות החיידקים על משטחי הדגימה. הקו המקווקו הכחול מציין את תוצאות הניתוח הסטטיסטי של צפיפות החיידקים על המסננים המכסים את משטחי הדגימה. קיצורים: CFU = יחידות יוצרות מושבה; A-EPD = תצהיר אלקטרופורטי לאחר חישול; EPD = תצהיר אלקטרופורטי לפני חישול; A = אנודיזציה לפני חישול; AA = אנודיזציה לאחר חישול. נתון זה שונה מ Lin et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: תמונות SEM מייצגות של E. coli גראם-שלילי ו-S. aureus גראם-חיובי שנחשפו ל-0-1.2 מ"ג/מ"ל nMgO. (A) E. coli הראה מורפולוגיה דומה ב-1.2 מ"ג/מ"ל ל-2.0 מ"ג/מ"ל nMgO. מסיבה זו, תמונה אחת במינון 1.2 מ"ג/מ"ל מוצגת כמייצגת של E. coli שנחשף לריכוזי nMgO גבוהים יותר. (B) S. aureus הראה גם מורפולוגיה דומה ב-1.2 מ"ג/מ"ל ל-2.0 מ"ג/מ"ל nMgO. מסיבה זו, תמונה אחת במינון 1.2 מ"ג/מ"ל מוצגת כמייצגת של S. aureus החשופה לריכוזי nMgO גבוהים יותר17. פסי קנה מידה = 5 מיקרומטר. nMgO = ננו-חלקיקים של תחמוצת מגנזיום. נתון זה שונה מ Nguyen et al.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: תמונות פלואורסצנטיות מייצגות של E. coli הודבקו על המצע עם כימות לאחר יום, יומיים ושלושה ימי דגירה. (A) תמונות פלואורסצנטיות של E. coli מוכתמות ב-10 מיקרומטר תיאופלבין T. (B) כימות של E. coli שנחשף לחומרים בעלי עניין באמצעות תאים/מ"ל. לא נמצאה היצמדות חיידקית ל-MgY_O לאחר יומיים של דגירה, וירידה בהיצמדות ל-MgY לאחר 3 ימי דגירה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. נתון זה שונה מ- Lock et al.15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הצגנו ארבע שיטות במבחנה (A-D) לאפיון הפעילות האנטיבקטריאלית של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים. בעוד שכל אחת מהשיטות הללו מכמתת את גדילת החיידקים ואת יכולת הקיום שלהם לאורך זמן בתגובה לננו-חומרים, קיימת שונות מסוימת בשיטות המשמשות למדידת צפיפות הזריעה הראשונית של חיידקים, גדילה וכדאיות לאורך זמן. שלוש מהשיטות הללו, שיטת התרבית המשותפת הישירה (A)17, שיטת התרבית הישירה (C)14 ושיטת החשיפה למגע ממוקד (D)16, מכמתות את גדילת החיידקים ואת כדאיותם לאחר תקופה של חשיפה לננו-חומרים על ידי ספירת יחידות ה-CFUs ליחידת נפח. לשם השוואה, שיטת החשיפה הישירה (B) מכמתת את גדילת החיידקים באמצעות מדידות צפיפות אופטית בדידה בזמן אמת (OD600). שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על תרבית משותפת ישירה, תרבית ישירה, ושיטות חשיפה ממוקדת מגע אם יש אילוצי זמן לכימות CFUs, ו / או קריאת צפיפות חיידקים בזמן אמת נדרשת עבור מחקרים קינטיים. אם לא ידוע על יעילות אנטיביוטיקה עבור מיני החיידקים שייבדקו בשיטת החשיפה הישירה, יש לבצע חיפוש ספרות כדי לקבוע את האנטיביוטיקות הנכונות ואת ערכי המיקרופון שלהן כדי לשמש כהפניות לקבוצות הננו-חומריות. אישור של ערכי המיקרופון יכול להיעשות על ידי השלמת עקומת סטנדרטיזציה, אשר מתווה את הקשר בין נתוני הספקטרופוטומטריה לבין כימות של יחידות יוצרות מושבה בנקודות זמן ספציפיות. תהליך זה מתאם את מספר התאים הנמצאים בתרבית בנקודות ספציפיות עם הצפיפות האופטית המתאימה. בנוסף, חיידקים בשלב הגדילה בפיגור נחשפים לננו-חלקיקים בשיטת התרבית המשותפת הישירה ולמשטחים ננו-מבניים בתרבית הישירה ובשיטות חשיפה ממוקדת. לעומת זאת, חיידקים בשלב הגידול הלוגריתמי נחשפים לננו-חלקיקים בשיטת החשיפה הישירה. יתר על כן, צפיפות הזריעה של חיידקים מכומתת כתאים/מ"ל בשיטת התרבית המשותפת הישירה, שיטת התרבית הישירה ושיטת החשיפה למגע ממוקד, ואילו הצפיפות האופטית (OD600) של חיידקים נמדדת כדי לעקוב אחר צמיחה בזמן אמת בשיטת החשיפה הישירה.

למרות שכל אחת מהשיטות הללו דומה במסגרתה, הן גם מציגות מאפיינים ייחודיים להבחנה בין ההשפעות של ננו-חלקיקים או משטחים ננו-מבניים על חיידקים. לדוגמה, שיטת התרבית המשותפת הישירה מאפיינת תגובות חיידקיות להגדלת ריכוזים נמדדים מראש של ננו-חלקיקים באמצעות כימות CFU/mL (איור 3). שיטה זו מייצרת ריכוזים מינימליים מעכבים ומינימום קוטלי חיידקים (MIC ו-MBC) של ננו-חלקיקים עבור מיני חיידקים בעלי עניין, ואם נבדקים מינים רבים, הריכוז החזק ביותר (MPC) של ננו-חלקיקים17. הזיהוי של MIC, MBC90-99.99 ו-MPC חיוני ליישום ננו-חלקיקים ביישומים במורד הזרם. לדוגמה, נתונים אלה יכולים להיות מיושמים על בדיקות in vivo של פעילות אנטיבקטריאלית של ננו-חלקיקים תוך שמירה על cytocompatibility כאשר ריכוזים פחות קטלניים זוהו גם. לעומת זאת, שיטת החשיפה הישירה מאפיינת את פעילות הננו-חלקיקים כבקטריוסטטית או קוטלת חיידקים באופן דומה לסיווג אנטיביוטיקה, שם יש לזהות השפעות סינרגטיות או בלתי רצויות לפני השימוש במחקר או בסביבה קלינית.

אפיון תרכובות אנטיבקטריאליות כבקטריוסטטיות או קוטלות חיידקים רלוונטי לשימוש קליני ולמחקר in vitro ו-in vivo 38. מסיבה זו, בעת תכנון שיטות לבחינת מאפיינים אלה, יש לזהות השפעות שליליות שעלולות להשפיע על התוצאות. כאן, שיטת החשיפה הישירה מסווגת ננו-חלקיקים כבקטריוסטטיים או קוטלי חיידקים עבור מיני חיידקים ספציפיים באמצעות מדידות בזמן אמת של צפיפות אופטית ב-600 ננומטר (איור 4). חיידקים בשלב הגידול הלוגריתמי מעורבבים עם ננו-חלקיקים ברמת המיקרופון כדי ליצור חיידקים ותרחיפים של ננו-חלקיקים. מתלים אלה נמדדים באופן דיסקרטי בזמן אמת כדי לקבוע את ההשפעות המתמשכות של חשיפה לננו-חלקיקים על החיידקים. כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו, חיידקים שגדלו בו זמנית בתרחיף עם אנטיביוטיקה בקטריוסטטית וחיידקית משמשים כאסמכתא כדי לאשר את שיעורי הצמיחה של החיידקים שנחשפו לננו-חלקיקים.

לשילוב של ננו-חלקיקים במדעי הביו-הנדסה, הקליניקה והסביבה עשויות להיות אפשרויות מרחיקות לכת, אך השימוש בנתונים האנטי-בקטריאליים של ננו-חלקיקים עבור מחקרי in vitro ו-in vivo על משטחים ננו-מבניים הוא מאתגר להשגה. מסיבה זו, הצגנו את התרבית הישירה ואת שיטות החשיפה למגע ממוקד כדי לאפיין את הפעילות האנטיבקטריאלית במבחנה של משטחים ננו-מבניים. שיטת התרבית הישירה בוחנת את ההשפעות האנטי-בקטריאליות של משטחים ננו-מבניים כאשר חיידקים נמצאים במגע ישיר עם החומרים המעניינים14. כאן, חיידקים המרחפים ב-rSBF בתוספת 10% FBS נחשפים למשטחים ננו-מבניים, ולאחר מכן כימות של צמיחת חיידקים לאורך זמן עבור חיידקים במגע ישיר עם פני השטח ובתרחיף סביב החומר המעניין (מגע עקיף) באמצעות CFU/mL. בעבר, תוצאות ניסוי שכללו ננו-מבנים מסגסוגת מגנזיום (סגסוגות ZC21 ו-ZSr41) הצביעו על כך שפעילויות אנטי-בקטריאליות גדלות כאשר החיידקים נמצאים במגע ישיר עם משטחים ננו-מבניים, בהשוואה למגע עקיף, שבו החיידקים נשארים בתרחיף עם מגע מועט או ללא מגע כלל14 (איור 5). לבסוף, שיטת המגע הממוקד מאפיינת פעילות אנטיבקטריאלית בממשק של חיידקים ומשטח ננו-מבני16. כאן, בחנו תחמוצת מגנזיום שעברה אנודיזציה או אלקטרופורטית שהושקעה על פני השטח של סגסוגת מגנזיום הניתנת לספיגה ביולוגית כדי לקבוע את ההפרעה הפוטנציאלית של הידבקות חיידקים והיווצרות ביופילם לאורך זמן. השיבוש בהיווצרות הביופילם יכול להיות קריטי לתהליכי ריפוי המטופלים, שכן ביופילמים נוטים לחמוק מתגובות חיסוניות של המארח ומטיפולים אנטיביוטיים39 ולגרום לזיהומים שקשה מאוד לטפל בהם.

כאן, אנו מציגים שיטה המותאמת לתקן התעשייתי היפני JIS Z 2801:200016. שיטה זו מבטיחה כי חיידקים מחוברים לנייר מסנן ניטרוצלולוז סטרילי ולאחר מכן חשיפה לאזור קבוע של פני השטח הננומטריים. זה מגביל את אפיון השפעות פני השטח על פעילות אנטיבקטריאלית לאזור הבדיקה בלבד. בתוצאות המייצגות, האנודיזציה לפני חישול (1.9A), אנודיזציה לאחר חישול (1.9AA) ותצהיר אלקטרופורטי לפני חישול (EPD) הדגימות הראו השפעות משמעותיות על הפחתת צמיחת חיידקים, כמו גם ניירות הסינון המתאימים להם בהשוואה לדגימות בקרת מגנזיום, טיטניום וזכוכית. התצהיר האלקטרופורטי לאחר חישול דגימות (A-EPD) היה יעיל גם בהפחתת צמיחת חיידקים, אולם תוצאה זו הייתה פחות משמעותית בהשוואה לתוצאות שהתקבלו עבור דגימות 1.9A, 1.9AA ו-EPD16 (איור 6).

לסיכום, כל שיטת in vitro המוצגת כאן קלה למדי לשליטה ומשלבת חומרים זולים וזמינים. שיטות אלה יכולות לשמש לאפיון אינטראקציות בין מגוון רחב של ננו-חומרים ומינים מיקרוביאליים שמעניינים חוקרים. הבנת הדמיון והשוני בין שיטות אלה נחוצה כדי לתכנן ניסויים אופטימליים כדי לעמוד ביעדי המחקר. כאן, הידע המדעי שנצבר משיטות מבחנה אלה יכול להיות מיושם על יישומים רפואיים במורד הזרם, שבהם אנטיביוטיקה חייבת להיות מוגבלת או לייצג גישה שלילית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

המחברים מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדע של ארה"ב (פרס NSF CBET 1512764 ו- NSF PIRE 1545852), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH NIDCR 1R03DE028631), מלגת פיתוח הפקולטה של אוניברסיטת קליפורניה (UC) ריג'נטס, הוועדה למענק זרעי מחקר (Huinan Liu), ומענק תוכנית חונכות המחקר לתארים מתקדמים של UC-Riverside שהוענק לפטרישיה הולט-טורס. המחברים מעריכים את הסיוע שניתן על ידי המתקן המרכזי למיקרוסקופיה ומיקרואנליזה מתקדמת (CFAMM) באוניברסיטת UC-Riverside לשימוש ב- SEM/EDS וד"ר פרי צ'אונג לשימוש ב- XRD. המחברים רוצים גם להודות למורגן אליזבת נטור וסמהיטה טומקור על עזרתם בניסויים ובניתוח הנתונים. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את הדעות של הקרן הלאומית למדע או המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Milipore Sigma Z336777
80 L NTRL Certified Convection Drying Oven  MTI Corporation BPG-7082 https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx
(hydroxymethyl) aminomethane buffer pH 8.5; Tris buffer  Sigma-Aldrich  42457
AnaSpec THIOFLAVIN T ULTRAPURE GRADE Fisher Scientific 50-850-291
Electron-multiplying charge-coupled device digital camera  Hamamatsu C9100-13
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 14-959-49B
Gluteraldehyde Sigma-Aldrich  G5882
Hemocytometer Brightline, Hausser Scientific 1492
Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) PerkinElmer 8000
Inverse microscope Nikon Eclipse Ti-S
Luria Bertani Broth Sigma Life Science  L3022
Luria Bertani Broth + agar Sigma Life Science  L2897
MacroTube 5.0   Benchmark Scientific C1005-T5-ST
Magnesium oxide nanoparticles US Research Nanomaterials, Inc Stock #: US3310   M MgO, 99+%, 20 nm
MS Semi-Micro Balance Mettler Toledo MS105D
Nitrocellulose paper Fisherbrand 09-801A
Non-tissue treated 12-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351143
Non-tissue treated 48-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351178
Non-tissue treated 96-well polystyrene plate Falcon Corning Brand  351172
Petri dish 100 mm VWR 470210-568
Petri dish, 15 mm Fisherbrand FB0875713A
pH meter VWR SP70P
Scanning electron microscopy (SEM) TESCAN  Vega3 SBH
Sonicator VWR 97043-936
Table top centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17
Table top centrifuge  Eppendorf Centrifuge 5430
Tryptic Soy Agar MP 1010617
Tryptic Soy Broth Sigma-Aldrich 22092-500G
UV-Vis spectrophotometer  Tecan Infinite 200 PRO https://lifesciences.tecan.com/plate_readers/infinite_200_pro
VWR Benchmark Incu-shaker 10L VWR N/A
X-ray power defraction  Panalytical N/A PANalytical Empyrean Series 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haque, M., Sartelli, M., McKimm, J., Abu Bakar, M. Health care-associated infections - An overview. Infection and Drug Resistance. 11, 2321-2333 (2018).
  2. O'Connell, K. M. G. Combating multidrug-resistant bacteria: Current strategies for the discovery of novel antibacterials. Angewandte Chemie. 52 (41), 10706-10733 (2013).
  3. Li, B., Webster, T. J. Bacteria antibiotic resistance: New challenges and opportunities for implant-associated orthopedic infections. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 22-32 (2018).
  4. Yung, D. B. Y., Sircombe, K. J., Pletzer, D. Friends or enemies? The complicated relationship between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 116 (1), 1-15 (2021).
  5. Adams, R. A. Rifamycin antibiotics and the mechanisms of their failure. The Journal of Antibiotics. 74 (11), 786-798 (2021).
  6. Harding, E. WHO global progress report on tuberculosis elimination. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (1), 19 (2020).
  7. Baptista, P. V. Nano-strategies to fight multidrug resistant bacteria-"A battle of the titans". Frontiers in Microbiology. 9, 1441 (2018).
  8. Seong, M., Lee, D. G. Silver nanoparticles against Salmonella enterica serotype typhimurium: Role of inner membrane dysfunction. Current Microbiology. 74 (6), 661-670 (2017).
  9. Dasgupta, N., Ramalingam, C. Silver nanoparticle antimicrobial activity explained by membrane rupture and reactive oxygen generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 477-485 (2016).
  10. Su, H. L. The disruption of bacterial membrane integrity through ROS generation induced by nanohybrids of silver and clay. Biomaterials. 30 (30), 5979-5987 (2009).
  11. Cui, Y. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials. 33 (7), 2327-2333 (2012).
  12. Ranjan, S., Ramalingam, C. Titanium dioxide nanoparticles induce bacterial membrane rupture by reactive oxygen species generation. Environmental Chemistry Letters. 14, 487-494 (2016).
  13. Kadiyala, U., Turali-Emre, E. S., Bahng, J. H., Kotov, N. A., VanEpps, J. S. Unexpected insights into antibacterial activity of zinc oxide nanoparticles against methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Nanoscale. 10 (10), 4927-4939 (2018).
  14. Zhang, C. Antimicrobial bioresorbable Mg-Zn-Ca alloy for bone repair in a comparison study with Mg-Zn-Sr alloy and pure Mg. ACS Biomaterials Science and Engineering. 6 (1), 517-538 (2020).
  15. Lock, J. Y. Degradation and antibacterial properties of magnesium alloys in artificial urine for potential resorbable ureteral stent applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 102 (3), 781-792 (2014).
  16. Lin, J., Nguyen, N. -Y. T., Zhang, C., Ha, A., Liu, H. H. Antimicrobial properties of MgO nanostructures on magnesium substrates. ACS Omega. 5 (38), 24613-24627 (2020).
  17. Nguyen, N. -Y. T., Grelling, N., Wetteland, C. L., Rosario, R., Liu, H. Antimicrobial activities and mechanisms of magnesium oxide nanoparticles (nMgO) against pathogenic bacteria, yeasts, and biofilms. Scientific Reports. 8 (1), 16260 (2018).
  18. Bindhu, M. R., Umadevi, M., Micheal, M. K., Arasu, M. V., Al-Dhabi, N. A. Structural morphological and optical properties of MgO nanoparticles for antibacterial applications. Materials Letters. 166, 19-22 (2016).
  19. He, Y. Study on the mechanism of antibacterial action of magnesium oxide nanoparticles against foodborne pathogens. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 54 (2016).
  20. Zhang, K., An, Y., Zhang, L., Dong, Q. Preparation of controlled nano-MgO and investigation of its bactericidal properties. Chemosphere. 89 (11), 1414-1418 (2012).
  21. Hayat, S. In vitro antibiofilm and anti-adhesion effects of magnesium oxide nanoparticles against antibiotic resistant bacteria. Microbiology and Immunology. 62 (4), 211-220 (2018).
  22. Dong, C. Investigation of Mg(OH)2 nanoparticles as an antibacterial agent. Journal of Nanoparticle Research. 12, 2101-2109 (2010).
  23. Halbus, A. F., Horozov, T. S., Paunov, V. N. Controlling the antimicrobial action of surface modified magnesium hydroxide nanoparticles. Biomimetics. 4 (2), 41 (2019).
  24. Pan, X. Investigation of antibacterial activity and related mechanism of a series of Nano-Mg(OH)2. ACS Applied Materials and Interfaces. 5 (3), 1137-1142 (2013).
  25. Ipe, D. S., Kumar, P. T. S., Love, R. M., Hamlet, S. M. Silver nanoparticles at biocompatible dosage synergistically increases bacterial susceptibility to antibiotics. Frontiers in Microbiology. 11, 1074 (2020).
  26. Parvekar, P., Palaskar, J., Metgud, S., Maria, R., Dutta, S. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of silver nanoparticles against Staphylococcus aureus. Biomaterial Investigations in Dentistry. 7 (1), 105-109 (2020).
  27. Loo, Y. Y. In vitro antimicrobial activity of green synthesized silver nanoparticles against selected gram-negative foodborne pathogens. Frontiers in Microbiology. 9, 1555 (2018).
  28. Ali, K. Microwave accelerated green synthesis of stable silver nanoparticles with Eucalyptus globulus leaf extract and their antibacterial and antibiofilm activity on clinical isolates. PLoS One. 10 (7), e0131178 (2015).
  29. Al-Jumaili, A., Alancherry, S., Bazaka, K., Jacob, M. V. Review on the antimicrobial properties of carbon nanostructures. Materials. 10 (9), 1066 (2017).
  30. MTI Corporation. 80L NTRL Certified Convection Drying Oven (18"x16"x18", 250°C) with Digital Temperature Controller (SSP) - BPG-7082. , https://www.mtixtl.com/BPG-7082.aspx (2022).
  31. CHEBI. Tris (CHEBI:9754). , https://www.ebi.ac.uk/chebi/searchId.do;?chebiId=CHEBI:9754 (2023).
  32. Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate buffer. Cold Spring Harbor Laboratory Press. , (2016).
  33. Barat, R., Montoya, T., Seco, A., Ferrer, J. Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems. Water Research. 45, 3744-3752 (2011).
  34. Carlsson, H., Aspegren, H., Lee, N., Hilmer, A. Calcium phosphate precipitation in biological phosphorus removal systems. Water Research. 31 (5), 1047-1055 (1997).
  35. Gonzalez, J., Hou, R. Q., Nidadavolu, E. P. S., Willumeit-Römer, R., Feyerabend, F. Magnesium degradation under physiological conditions - Best practice. Bioactive Materials. 3 (2), 174-185 (2018).
  36. Oyane, A., et al. Preparation and assessment of revised simulated body fluids. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 65 (2), 188-195 (2003).
  37. Xia, B., et al. Amyloid histology stain for rapid bacterial endospore imaging. Journal of Clinical Microbiology. 49 (8), 2966-2975 (2011).
  38. Pankey, G. A., Sabath, L. D. Clinical relevance of bacteriostatic versus bactericidal mechanisms of action in the treatment of Gram-positive bacterial infections. Clinical Infectious Diseases. 38 (6), 864-870 (2004).
  39. Ribeiro, M., Monteiro, F. J., Ferraz, M. P. Infection of orthopedic implants with emphasis on bacterial adhesion process and techniques used in studying bacterial-material interactions. Biomatter. 2 (4), 176-194 (2012).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 194 ננו-חלקיקים אנטי-מיקרוביאליים משטחים ננו-מבניים ריכוז מעכב מינימלי (MIC) ריכוז חיידקים מינימלי (MBC) תלוי מינון חיידק חיידקים
הערכת פעילויות אנטי-מיקרוביאליות של ננו-חלקיקים ומשטחים ננו-מבניים <em>במבחנה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu,… More

Holt-Torres, P. S., Chen, Y., Liu, H. H. Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro. J. Vis. Exp. (194), e64712, doi:10.3791/64712 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter