Определение тепловых пределов для зоопланктона с помощью теплового блока
Summary
Настоящий протокол иллюстрирует использование коммерчески доступных компонентов для генерации стабильного и линейного теплового градиента. Такой градиент затем может быть использован для определения верхнего теплового предела планктонных организмов, особенно личинок беспозвоночных.
Abstract
Тепловые пределы и широта широко используются для прогнозирования распространения видов. Поскольку глобальная температура продолжает расти, понимание того, как тепловой предел изменяется с акклиматизацией и как он варьируется между этапами жизни и популяциями, имеет жизненно важное значение для определения уязвимости видов к будущему потеплению. Большинство морских организмов имеют сложные жизненные циклы, которые включают ранние планктонные стадии. Хотя количественная оценка теплового предела этих небольших ранних стадий развития (от десятков до сотен микрон) помогает выявить узкие места в развитии, этот процесс может быть сложным из-за небольшого размера целевых организмов, больших требований к пространству на скамейке и высокой начальной стоимости изготовления. Здесь представлена установка, ориентированная на небольшие объемы (от мл до десятков мл). Эта установка сочетает в себе коммерчески доступные компоненты для создания стабильного и линейного теплового градиента. Также представлены производственные спецификации установки, а также процедуры введения и перечисления живых и мертвых людей и расчета летальной температуры.
Introduction
Термическая толерантность является ключом к выживанию и функции организмов 1,2. Поскольку планета продолжает нагреваться из-за антропогенных выбросов углерода, все большее внимание уделяется определению и применению тепловых пределов3. Различные конечные точки, такие как смертность, неспособность развиваться и потеря подвижности, использовались для определения как верхних, так и нижних температурных пределов4. Эти тепловые пределы часто считаются прокси для тепловой ниши организма. Эта информация, в свою очередь, используется для выявления видов, которые более уязвимы к глобальному потеплению, а также для прогнозирования будущего распространения видов и результирующих видовых взаимодействий 3,5,6,7. Однако определение тепловых пределов, особенно для небольших планктонных организмов, может быть сложной задачей.
Для планктонных организмов, особенно личиночных стадий морских беспозвоночных, тепловой предел может быть определен путем хронического воздействия. Хроническое воздействие достигается путем выращивания личинок при нескольких температурах в течение дней до недель и определения температуры, при которой выживаемость личинок и/или скорость развития снижаются на 8,9,10. Однако этот подход является довольно трудоемким и требует больших инкубаторов и опыта в личиночном животноводстве (см. ссылку11 для хорошего введения в культивирование личинок морских беспозвоночных).
В качестве альтернативы, острое воздействие теплового стресса может быть использовано для определения тепловых пределов. Часто этот подход к определению включает в себя помещение небольших флаконов с личинками в сухие ванны с контролируемой температурой 12,13,14, использование функций теплового градиента в тепловых циклерах ПЦР 15,16 или помещение стеклянных флаконов / микроцентрифужных трубок вдоль теплового градиента, генерируемого примененным нагревом и охлаждением на концах больших алюминиевых блоков с отверстиями, в которые флаконы плотно помещаются17, 18,19. Типичные сухие ванны генерируют единичную температуру; следовательно, несколько блоков должны эксплуатироваться одновременно для оценки производительности в диапазоне температур. Термоциклеры генерируют градиент, но вмещают только небольшой объем образца (120 мкл) и требуют тщательных манипуляций. Подобно тепловым циклерам, большие алюминиевые блоки создают линейные и стабильные температурные градиенты. Оба подхода могут быть объединены с логистической или пробитовой регрессией для вычисления летальной температуры для 50% процентов населения (LT50)12,20,21. Тем не менее, используемые алюминиевые блоки были ~ 100 см в длину; этот размер требует большого лабораторного пространства и доступа к специализированным компьютерным фрезерным станкам с числовым программным управлением для сверления отверстий. Вместе с использованием двух гидромассажных водяных бань для поддержания целевой температуры финансовые затраты на сборку установки высоки.
Поэтому эта работа направлена на разработку альтернативных средств для генерации стабильного линейного градиента температуры с коммерчески доступными деталями. Такой продукт должен иметь небольшую площадь и должен быть легко использован для экспериментов по воздействию острого теплового стресса для планктонных организмов. Этот протокол разработан с использованием зоопланктона размером <1 мм в качестве целевых организмов, и, таким образом, он был оптимизирован для использования микроцентрифужной трубки объемом 1,5 или 2 мл. Более крупным исследуемым организмам потребуются контейнеры больше, чем используемые микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, и увеличенные отверстия в алюминиевых блоках.
Помимо того, чтобы сделать экспериментальный аппарат более доступным, эта работа направлена на упрощение конвейера обработки данных. В то время как коммерческое статистическое программное обеспечение предоставляет процедуры для вычисления LT50 с использованием логистической или пробитной регрессии, стоимость лицензирования нетривиальна. Поэтому простой в использовании скрипт, основанный на статистической программе R22 с открытым исходным кодом, сделает анализ данных более доступным.
Этот протокол показывает, как компактный тепловой блок может быть изготовлен из коммерчески доступных деталей и применен к воздействию зоопланктона (личинок песочного доллара Dendraster excentricus) на острый тепловой стресс для определения их верхнего теплового предела.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает доступный и настраиваемый подход к определению тепловых пределов малых планктонных организмов при остром тепловом воздействии. Конструкция с 10 отверстиями и гибкие конечные точки температуры, контролируемые водяной баней на нижнем конце и нагревателем на …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Исследовательским фондом факультета колледжа Суортмор [KC] и Летней исследовательской стипендией Роберта Рейнольдса и Люсинды Льюис ’70 для BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
