קביעת גבולות תרמיים עבור זואופלנקטון באמצעות בלוק חום
Summary
הפרוטוקול הנוכחי ממחיש את השימוש ברכיבים זמינים מסחרית ליצירת שיפוע תרמי יציב וליניארי. לאחר מכן ניתן להשתמש בשיפוע כזה כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון של אורגניזמים פלנקטוניים, במיוחד זחלים חסרי חוליות.
Abstract
מגבלות תרמיות ורוחב נעשה שימוש נרחב כדי לחזות את תפוצת המינים. ככל שהטמפרטורה העולמית ממשיכה לעלות, הבנת האופן שבו הגבול התרמי משתנה עם התאקלמות וכיצד הוא משתנה בין שלבי החיים והאוכלוסיות היא חיונית לקביעת פגיעותם של מינים להתחממות עתידית. לרוב האורגניזמים הימיים יש מחזורי חיים מורכבים הכוללים שלבים פלנקטוניים מוקדמים. בעוד שכימות הגבול התרמי של שלבי התפתחות מוקדמים קטנים אלה (עשרות עד מאות מיקרונים) מסייע בזיהוי צווארי בקבוק התפתחותיים, תהליך זה יכול להיות מאתגר בשל גודלם הקטן של אורגניזמי המטרה, דרישת שטח ספסל גדול ועלות ייצור ראשונית גבוהה. כאן מוצג מערך המיועד לנפחים קטנים (מ”ל עד עשרות מ”ל). מערך זה משלב רכיבים הזמינים באופן מסחרי ליצירת שיפוע תרמי יציב וליניארי. כמו כן מוצגים מפרטי הייצור של המערך, כמו גם נהלים להצגה וספירה של אנשים חיים לעומת מתים וחישוב טמפרטורה קטלנית.
Introduction
סובלנות תרמית היא המפתח להישרדותם ולתפקודם של אורגניזמים 1,2. ככל שכדור הארץ ממשיך להתחמם עקב פליטות פחמן אנתרופוגניות, תשומת לב גוברת מוקדשת לקביעה וליישום של מגבלות תרמיות3. נקודות קצה שונות, כגון תמותה, אי התפתחות ואובדן ניידות, שימשו לקביעת גבולות תרמיים עליונים ותחתונים4. גבולות תרמיים אלה נחשבים לעתים קרובות פרוקסי עבור נישה תרמית של אורגניזם. מידע זה משמש בתורו לזיהוי מינים פגיעים יותר להתחממות כדור הארץ, כמו גם לחיזוי תפוצת מינים עתידיים ואינטראקציות המינים הנובעות מכך 3,5,6,7. עם זאת, קביעת גבולות תרמיים, במיוחד עבור אורגניזמים פלנקטוניים קטנים, יכולה להיות מאתגרת.
עבור אורגניזמים פלנקטוניים, במיוחד שלבי הזחלים של חסרי חוליות ימיים, ניתן לקבוע את הגבול התרמי באמצעות חשיפה כרונית. חשיפה כרונית מושגת על ידי גידול זחלים במספר טמפרטורות במשך ימים עד שבועות וקביעת הטמפרטורה שבה הזחלים שורדים ו/או קצב התפתחותי מפחיתים 8,9,10. עם זאת, גישה זו גוזלת זמן רב למדי ודורשת אינקובטורים גדולים וניסיון בגידול זחלים (ראה הפניה11 למבוא טוב לגידול זחלים חסרי חוליות ימיים).
לחלופין, ניתן להשתמש בחשיפה חריפה ללחץ תרמי כדי לקבוע גבולות תרמיים. לעתים קרובות, גישת קביעה זו כוללת הצבת בקבוקונים קטנים עם זחלים באמבטיות יבשות מבוקרות טמפרטורה 12,13,14, מינוף פונקציות שיפוע תרמי במחזורים תרמייםPCR 15,16, או הצבת בקבוקוני זכוכית / צינורות מיקרוצנטריפוגה לאורך שיפוע תרמי שנוצר על ידי חימום וקירור מיושמים בקצוות של בלוקי אלומיניום גדולים עם חורים שבהם הבקבוקונים מתאימים להתכרבל 17, 18,19. אמבטיות יבשות טיפוסיות מייצרות טמפרטורה אחת; לפיכך, יש להפעיל יחידות מרובות בו זמנית כדי להעריך את הביצועים בטווח טמפרטורות. מחזורים תרמיים מייצרים שיפוע אך מכילים רק נפח דגימה קטן (120 μL) ודורשים מניפולציות זהירות. בדומה למחזורים תרמיים, בלוקי אלומיניום גדולים יוצרים שיפועי טמפרטורה ליניאריים ויציבים. שתי הגישות יכולות להיות משולבות עם רגרסיה לוגיסטית או פרוביט כדי לחשב את הטמפרטורה הקטלנית עבור 50% אחוז מהאוכלוסייה (LT50)12,20,21. עם זאת, בלוקים אלומיניום בשימוש היו ~ 100 ס”מ אורך; גודל זה דורש שטח מעבדה גדול וגישה למכונות כרסום ממוחשבות מיוחדות לבקרה נומרית כדי לקדוח את החורים. יחד עם שימוש בשני אמבטיות מים ברמה מחקרית כדי לשמור על טמפרטורת היעד, העלות הכספית של הרכבת ההתקנה היא גבוהה.
לכן, עבודה זו שואפת לפתח אמצעי חלופי ליצירת שיפוע טמפרטורה יציב וליניארי עם חלקים זמינים מסחרית. מוצר כזה חייב להיות בעל טביעת רגל קטנה ואמור להיות מסוגל לשמש בקלות לניסויים בחשיפה ללחץ תרמי חריף עבור אורגניזמים פלנקטוניים. פרוטוקול זה פותח עם זואופלנקטון שגודלו <1 מ"מ כאורגניזמים מטרה, ולכן הוא הותאם לשימוש בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 או 2 מ"ל. אורגניזמים מחקריים גדולים יותר ידרשו מכולות גדולות יותר מצינורות המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המשמשים וחורים מוגדלים בגושי האלומיניום.
בנוסף להפיכת מנגנון הניסוי לנגיש יותר, עבודה זו נועדה לפשט את צינור עיבוד הנתונים. בעוד שתוכנה סטטיסטית מסחרית מספקת שגרות לחישוב LT50 באמצעות רגרסיה לוגיסטית או פרוביט, עלות הרישוי אינה טריוויאלית. לכן, סקריפט קל לשימוש המסתמך על תוכנית הסטטיסטיקה בקוד פתוח R22 יהפוך את ניתוח הנתונים לנגיש יותר.
פרוטוקול זה מראה כיצד ניתן לייצר גוש חום קומפקטי עם חלקים זמינים מסחרית וליישם אותו על חשיפת זואופלנקטון (זחלי דנדרסטר אקסצנטריקוס של דולר החול) ללחץ חום חריף כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק גישה נגישה וניתנת להתאמה אישית כדי לקבוע את הגבולות התרמיים של אורגניזמים פלנקטון קטנים באמצעות חשיפה תרמית חריפה. העיצוב בן 10 הגומות ונקודות הקצה הגמישות לטמפרטורה, הנשלטות על ידי אמבט המים בקצה התחתון והמחמם בקצה העליון, מאפשרים לקבוע LT50 בדייקנות. באמצעות גישה זו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר הפקולטית של מכללת סוורת’מור [KC] ומלגת רוברט ריינולדס ולוסינדה לואיס ’70 מחקר קיץ עבור BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
