تحديد الحدود الحرارية للعوالق الحيوانية باستخدام كتلة حرارية
Summary
يوضح البروتوكول الحالي استخدام المكونات المتاحة تجاريا لتوليد تدرج حراري مستقر وخطي. يمكن بعد ذلك استخدام هذا التدرج لتحديد الحد الحراري الأعلى للكائنات العوالق ، وخاصة يرقات اللافقاريات.
Abstract
تم استخدام الحدود الحرارية والعرض على نطاق واسع للتنبؤ بتوزيع الأنواع. مع استمرار ارتفاع درجة الحرارة العالمية ، فإن فهم كيفية تغير الحد الحراري مع التأقلم وكيف يختلف بين مراحل الحياة والسكان أمر حيوي لتحديد مدى تعرض الأنواع للاحترار في المستقبل. معظم الكائنات البحرية لها دورات حياة معقدة تشمل مراحل العوالق المبكرة. في حين أن تحديد الحد الحراري لهذه المراحل التنموية المبكرة الصغيرة (عشرات إلى مئات الميكرونات) يساعد في تحديد الاختناقات التنموية ، يمكن أن تكون هذه العملية صعبة بسبب صغر حجم الكائنات الحية المستهدفة ، ومتطلبات مساحة مقاعد البدلاء الكبيرة ، وارتفاع تكلفة التصنيع الأولية. هنا ، يتم تقديم إعداد موجه نحو أحجام صغيرة (مل إلى عشرات مل). يجمع هذا الإعداد بين المكونات المتاحة تجاريا لتوليد تدرج حراري مستقر وخطي. كما يتم عرض مواصفات الإنتاج الخاصة بالإعداد ، بالإضافة إلى إجراءات إدخال وتعداد الأفراد الأحياء مقابل الأفراد الأموات وحساب درجة الحرارة المميتة.
Introduction
التسامح الحراري هو مفتاح بقاء الكائنات الحية ووظيفتها 1,2. مع استمرار ارتفاع درجة حرارة الكوكب بسبب انبعاثات الكربون البشرية المنشأ ، يتم إيلاء اهتمام متزايد لتحديد وتطبيق الحدود الحرارية3. تم استخدام نقاط نهاية مختلفة ، مثل الوفيات والفشل في التطور وفقدان الحركة ، لتحديد الحدود الحرارية العليا والسفلى4. غالبا ما تعتبر هذه الحدود الحرارية بديلا عن المكانة الحرارية للكائن الحي. تستخدم هذه المعلومات بدورها لتحديد الأنواع الأكثر عرضة للاحترار العالمي ، وكذلك التنبؤ بتوزيع الأنواع في المستقبل وتفاعلات الأنواع الناتجة3،5،6،7. ومع ذلك ، فإن تحديد الحدود الحرارية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الصغيرة العوالق ، يمكن أن يكون صعبا.
بالنسبة للكائنات العوالق ، وخاصة المراحل اليرقية لللافقاريات البحرية ، يمكن تحديد الحد الحراري من خلال التعرض المزمن. يتم تحقيق التعرض المزمن عن طريق تربية اليرقات في درجات حرارة متعددة على مدى أيام إلى أسابيع وتحديد درجة الحرارة التي ينخفض عندها بقاء اليرقات و / أو معدل نموها8،9،10. ومع ذلك، فإن هذا النهج يستغرق وقتا طويلا ويتطلب حاضنات كبيرة وخبرة في تربية اليرقات (انظر المرجع11 للحصول على مقدمة جيدة لاستزراع يرقات اللافقاريات البحرية).
بدلا من ذلك ، يمكن استخدام التعرض الحاد للإجهاد الحراري لتحديد الحدود الحرارية. في كثير من الأحيان ، يتضمن نهج التحديد هذا وضع قوارير صغيرة مع اليرقات في الحمامات الجافة التي يتم التحكم في درجة حرارتها 12،13،14 ، والاستفادة من وظائف التدرج الحراري في أجهزة التدوير الحراري PCR 15،16 ، أو وضع قوارير زجاجية / أنابيب طرد مركزي دقيقة على طول التدرج الحراري الناتج عن التسخين والتبريد المطبقين على نهايات كتل الألمنيوم الكبيرة مع ثقوب تتناسب فيها القوارير بشكل مريح 17 ، 18,19. الحمامات الجافة النموذجية تولد درجة حرارة واحدة. وبالتالي ، يجب تشغيل وحدات متعددة في وقت واحد لتقييم الأداء عبر مجموعة من درجات الحرارة. تولد أجهزة التدوير الحراري تدرجا ولكنها تستوعب فقط حجم عينة صغير (120 ميكرولتر) وتتطلب معالجات دقيقة. على غرار الدراجات الحرارية ، تخلق كتل الألمنيوم الكبيرة تدرجات حرارية خطية ومستقرة. يمكن أن يقترن كلا النهجين بالانحدار اللوجستي أو المحتمل لحساب درجة الحرارة المميتة ل 50٪ من السكان (LT50) 12،20،21. ومع ذلك ، كانت كتل الألمنيوم المستخدمة ~ 100 سم. يتطلب هذا الحجم مساحة معملية كبيرة وإمكانية الوصول إلى آلات طحن التحكم العددي المتخصصة بالكمبيوتر لحفر الثقوب. جنبا إلى جنب مع استخدام حمامين مائيين من الدرجة البحثية للحفاظ على درجة الحرارة المستهدفة ، فإن التكلفة المالية لتجميع الإعداد مرتفعة.
لذلك ، يهدف هذا العمل إلى تطوير وسيلة بديلة لتوليد تدرج درجة حرارة خطي مستقر مع الأجزاء المتاحة تجاريا. يجب أن يكون لمثل هذا المنتج بصمة صغيرة ويجب أن يكون قابلا للاستخدام بسهولة في تجارب التعرض للإجهاد الحراري الحاد للكائنات العوالق. تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام العوالق الحيوانية التي يبلغ حجمها <1 مم ككائنات مستهدفة ، وبالتالي ، تم تحسينها لاستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 أو 2 مل. ستتطلب الكائنات الحية الأكبر حجما حاويات أكبر من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل المستخدمة والثقوب المتضخمة في كتل الألومنيوم.
بالإضافة إلى جعل الجهاز التجريبي أكثر سهولة ، يهدف هذا العمل إلى تبسيط خط أنابيب معالجة البيانات. بينما توفر البرامج الإحصائية التجارية إجراءات روتينية لحساب LT50 باستخدام الانحدار اللوجستي أو المحتمل ، فإن تكلفة الترخيص ليست تافهة. لذلك ، فإن البرنامج النصي سهل الاستخدام الذي يعتمد على البرنامج الإحصائي مفتوح المصدر R22 سيجعل تحليل البيانات أكثر سهولة.
يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن تصنيع كتلة حرارية مدمجة بأجزاء متاحة تجاريا وتطبيقها على تعريض العوالق الحيوانية (يرقات الدولار الرملي Dendraster excentricus) للإجهاد الحراري الحاد لتحديد الحد الحراري الأعلى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول نهجا يمكن الوصول إليه وقابل للتخصيص لتحديد الحدود الحرارية لكائنات العوالق الصغيرة من خلال التعرض الحراري الحاد. يتيح التصميم المكون من 10 ثقوب ونقاط نهاية درجة الحرارة المرنة ، التي يتم التحكم فيها بواسطة حمام مائي في الطرف السفلي والسخان في الطرف العلوي ، تحديد LT50…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث أعضاء هيئة التدريس في كلية سوارثمور [KC] وزمالة روبرت رينولدز ولوسيندا لويس 70 الصيفية للأبحاث ل BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
