Isı Bloğu Kullanarak Zooplankton için Termal Sınırların Belirlenmesi
Summary
Mevcut protokol, kararlı ve doğrusal bir termal gradyan oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bileşenlerin kullanımını göstermektedir. Bu gradyan daha sonra planktonik organizmaların, özellikle omurgasız larvaların üst termal sınırını belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Termal sınırlar ve genişlik, tür dağılımını tahmin etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Küresel sıcaklık yükselmeye devam ettikçe, termal sınırın iklimlendirme ile nasıl değiştiğini ve yaşam aşamaları ile popülasyonlar arasında nasıl değiştiğini anlamak, türlerin gelecekteki ısınmaya karşı savunmasızlığını belirlemek için hayati öneme sahiptir. Çoğu deniz organizması, erken planktonik aşamaları içeren karmaşık yaşam döngülerine sahiptir. Bu küçük erken gelişim aşamalarının (onlarca ila yüzlerce mikron) termal sınırını ölçmek, gelişimsel darboğazları belirlemeye yardımcı olurken, bu süreç, hedef organizmaların küçük boyutu, büyük tezgah alanı gereksinimi ve yüksek ilk üretim maliyeti nedeniyle zor olabilir. Burada, küçük hacimlere (mL’den onlarca mL’ye) yönelik bir kurulum sunulmaktadır. Bu kurulum, kararlı ve doğrusal bir termal gradyan oluşturmak için ticari olarak temin edilebilen bileşenleri birleştirir. Kurulumun üretim şartnamelerinin yanı sıra canlı ve ölü bireyleri tanıtmak ve numaralandırmak ve ölümcül sıcaklığı hesaplamak için prosedürler de sunulmaktadır.
Introduction
Termal tolerans, organizmaların hayatta kalmasının ve fonksiyonunun anahtarıdır 1,2. Gezegen antropojenik karbon emisyonları nedeniyle ısınmaya devam ettikçe, termal sınırların belirlenmesine ve uygulanmasına giderek daha fazla dikkat edilmektedir3. Mortalite, gelişme başarısızlığı ve hareketlilik kaybı gibi çeşitli sonlanım noktaları, hem üst hem de alt termal sınırları belirlemek için kullanılmıştır4. Bu termal sınırlar genellikle bir organizmanın termal nişi için bir vekil olarak kabul edilir. Bu bilgi, küresel ısınmaya karşı daha savunmasız olan türleri tanımlamanın yanı sıra gelecekteki tür dağılımını ve ortaya çıkan tür etkileşimlerini tahmin etmek için kullanılır 3,5,6,7. Bununla birlikte, özellikle küçük planktonik organizmalar için termal sınırların belirlenmesi zor olabilir.
Planktonik organizmalar için, özellikle deniz omurgasızlarının larva aşamaları için, termal sınır kronik maruz kalma yoluyla belirlenebilir. Kronik maruziyet, larvaların günler ila haftalar boyunca çeşitli sıcaklıklarda yetiştirilmesi ve larva hayatta kalma ve / veya gelişim hızının 8,9,10 azaldığı sıcaklığın belirlenmesiyle elde edilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım oldukça zaman alıcıdır ve larva yetiştiriciliğinde büyük inkübatörler ve deneyim gerektirir (deniz omurgasız larvalarının kültürlenmesine iyi bir giriş için referans11’e bakınız).
Alternatif olarak, termal strese akut maruz kalma, termal sınırları belirlemek için kullanılabilir. Genellikle, bu belirleme yaklaşımı, larvalı küçük şişelerin sıcaklık kontrollü kuru banyolarayerleştirilmesini içerir 12,13,14, PCR termal döngüleyiciler15,16’daki termal gradyan fonksiyonlarından yararlanmayı veya cam şişeler / mikrosantrifüj tüplerini, şişelerin sıkıca oturduğu deliklere sahip büyük alüminyum blokların uçlarına uygulanan ısıtma ve soğutma ile üretilen bir termal gradyan boyunca koymayı içerir 17, 18,19. Tipik kuru banyolar tek bir sıcaklık üretir; Bu nedenle, bir dizi sıcaklıktaki performansı değerlendirmek için birden fazla ünite aynı anda çalıştırılmalıdır. Termal döngüleyiciler bir gradyan üretir, ancak yalnızca küçük bir numune hacmini (120 μL) barındırır ve dikkatli manipülasyonlar gerektirir. Termal döngüleyicilere benzer şekilde, büyük alüminyum bloklar doğrusal ve kararlı sıcaklık gradyanları oluşturur. Her iki yaklaşım da, nüfusun% 50’si için ölümcül sıcaklığı hesaplamak için lojistik veya probit regresyonu ile birleştirilebilir (LT50)12,20,21. Bununla birlikte, kullanılan alüminyum bloklar ~ 100 cm uzunluğundaydı; Bu boyut, büyük bir laboratuvar alanı ve delikleri delmek için özel bilgisayarlı sayısal kontrollü freze makinelerine erişim gerektirir. Hedef sıcaklığı korumak için iki araştırma sınıfı su banyosu kullanmanın yanı sıra, kurulumu monte etmenin finansal maliyeti yüksektir.
Bu nedenle, bu çalışma, ticari olarak temin edilebilen parçalarla kararlı, doğrusal bir sıcaklık gradyanı oluşturmak için alternatif bir araç geliştirmeyi amaçlamaktadır. Böyle bir ürün küçük bir ayak izine sahip olmalı ve planktonik organizmalar için akut termal strese maruz kalma deneyleri için kolayca kullanılabilmelidir. Bu protokol, hedef organizmalar olarak <1 mm büyüklüğünde zooplankton ile geliştirilmiştir ve bu nedenle 1.5 veya 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün kullanımı için optimize edilmiştir. Daha büyük çalışma organizmaları, kullanılan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinden daha büyük kaplara ve alüminyum bloklardaki büyütülmüş deliklere ihtiyaç duyacaktır.
Deney aparatını daha erişilebilir hale getirmenin yanı sıra, bu çalışma veri işleme boru hattını basitleştirmeyi amaçlamaktadır. Ticari istatistik yazılımı, lojistik veya probit regresyonunu kullanarak LT50’yi hesaplamak için rutinler sağlarken, lisanslama maliyeti önemsiz değildir. Bu nedenle, açık kaynaklı istatistik programı R22’ye dayanan kullanımı kolay bir komut dosyası, veri analizini daha erişilebilir hale getirecektir.
Bu protokol, kompakt bir ısı bloğunun ticari olarak temin edilebilen parçalarla nasıl üretilebileceğini ve üst termal sınırlarını belirlemek için zooplanktonları (kum doları Dendraster excentricus’un larvaları) akut ısı stresine maruz bırakmak için nasıl uygulanabileceğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, akut termal maruziyet yoluyla küçük plankton organizmalarının termal sınırlarını belirlemek için erişilebilir ve özelleştirilebilir bir yaklaşım sağlar. Alt uçtaki su banyosu ve üst uçtaki ısıtıcı tarafından kontrol edilen 10 delikli tasarım ve esnek sıcaklık uç noktaları, LT50’nin hassas bir şekilde belirlenmesini sağlar. Bu yaklaşım kullanılarak, termal sınırda <1 °C olan bir fark tespit edilebilir (Şekil 3). Bu yaklaşım, çe?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Swarthmore College [KC] Fakülte Araştırma Fonu ve BJ için Robert Reynolds ve Lucinda Lewis ’70 Yaz Araştırma Bursu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
