Determinación de los límites térmicos para el zooplancton utilizando un bloque de calor
Summary
El presente protocolo ilustra el uso de componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. Dicho gradiente se puede utilizar para determinar el límite térmico superior de organismos planctónicos, particularmente larvas de invertebrados.
Abstract
Los límites térmicos y la amplitud se han utilizado ampliamente para predecir la distribución de las especies. A medida que la temperatura global continúa aumentando, comprender cómo cambia el límite térmico con la aclimatación y cómo varía entre las etapas de la vida y las poblaciones es vital para determinar la vulnerabilidad de las especies al calentamiento futuro. La mayoría de los organismos marinos tienen ciclos de vida complejos que incluyen etapas planctónicas tempranas. Si bien cuantificar el límite térmico de estas pequeñas etapas tempranas del desarrollo (decenas a cientos de micras) ayuda a identificar los cuellos de botella del desarrollo, este proceso puede ser un desafío debido al pequeño tamaño de los organismos objetivo, el gran requisito de espacio de banco y el alto costo de fabricación inicial. Aquí, se presenta una configuración que está orientada a volúmenes pequeños (ml a decenas de ml). Esta configuración combina componentes disponibles comercialmente para generar un gradiente térmico estable y lineal. También se presentan las especificaciones de producción de la configuración, así como los procedimientos para introducir y enumerar individuos vivos versus muertos y calcular la temperatura letal.
Introduction
La tolerancia térmica es clave para la supervivencia y función de los organismos 1,2. A medida que el planeta continúa calentándose debido a las emisiones antropogénicas de carbono, se está prestando cada vez más atención a la determinación y aplicación de límites térmicos3. Se han utilizado varios criterios de valoración, como la mortalidad, la falta de desarrollo y la pérdida de movilidad, para determinar los límites térmicos superior e inferior4. Estos límites térmicos a menudo se consideran un proxy para el nicho térmico de un organismo. Esta información se utiliza a su vez para identificar especies que son más vulnerables al calentamiento global, así como para predecir la distribución futura de las especies y las interacciones resultantesentre especies 3,5,6,7. Sin embargo, determinar los límites térmicos, especialmente para pequeños organismos planctónicos, puede ser un desafío.
Para los organismos planctónicos, particularmente las etapas larvales de los invertebrados marinos, el límite térmico puede determinarse a través de la exposición crónica. La exposición crónica se logra criando larvas a varias temperaturas durante días o semanas y determinando la temperatura a la que la supervivencia larvaria y / o la tasa dedesarrollo reduce 8,9,10. Sin embargo, este enfoque requiere bastante tiempo y requiere grandes incubadoras y experiencia en la cría de larvas (consulte la referencia11 para una buena introducción al cultivo de larvas de invertebrados marinos).
Alternativamente, la exposición aguda al estrés térmico se puede utilizar para determinar los límites térmicos. A menudo, este enfoque de determinación implica colocar viales pequeños con larvas en baños secos con temperatura controlada 12,13,14, aprovechar las funciones de gradiente térmico en termocicladores de PCR 15,16, o colocar viales de vidrio / tubos de microcentrífuga a lo largo de un gradiente térmico generado por calentamiento y enfriamiento aplicados en los extremos de grandes bloques de aluminio con orificios en los que los viales encajan cómodamente 17, 18,19. Los baños secos típicos generan una sola temperatura; Por lo tanto, se deben operar varias unidades simultáneamente para evaluar el rendimiento en un rango de temperaturas. Los termocicladores generan un gradiente, pero solo acomodan un pequeño volumen de muestra (120 μL) y requieren manipulaciones cuidadosas. Al igual que los termocicladores, los grandes bloques de aluminio crean gradientes de temperatura lineales y estables. Ambos enfoques pueden combinarse con regresión logística o probit para calcular la temperatura letal para el 50% por ciento de la población (LT50)12,20,21. Sin embargo, los bloques de aluminio utilizados tenían ~ 100 cm de largo; Este tamaño exige un gran espacio de laboratorio y acceso a fresadoras especializadas de control numérico por computadora para perforar los agujeros. Junto con el uso de dos baños de agua de grado de investigación para mantener la temperatura objetivo, el costo financiero de ensamblar la configuración es alto.
Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo desarrollar un medio alternativo para generar un gradiente de temperatura estable y lineal con piezas disponibles comercialmente. Dicho producto debe tener una huella pequeña y debe poder usarse fácilmente para experimentos de exposición al estrés térmico agudo para organismos planctónicos. Este protocolo se desarrolla con zooplancton que tiene un tamaño de <1 mm como organismos objetivo, y por lo tanto, se optimizó para el uso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 o 2 ml. Los organismos de estudio más grandes requerirán contenedores más grandes que los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml utilizados y orificios agrandados en los bloques de aluminio.
Además de hacer que el aparato experimental sea más accesible, este trabajo tiene como objetivo simplificar la tubería de procesamiento de datos. Si bien el software estadístico comercial proporciona rutinas para calcular LT50 utilizando regresión logística o probit, el costo de la licencia no es trivial. Por lo tanto, un script fácil de usar que se basa en el programa estadístico de código abierto R22 haría que el análisis de datos fuera más accesible.
Este protocolo muestra cómo se puede fabricar un bloque térmico compacto con piezas disponibles comercialmente y aplicarse para exponer el zooplancton (larvas del dólar de arena Dendraster excentricus) a un estrés térmico agudo para determinar su límite térmico superior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo proporciona un enfoque accesible y personalizable para determinar los límites térmicos de pequeños organismos de plancton a través de la exposición térmica aguda. El diseño de 10 orificios y los puntos finales de temperatura flexibles, controlados por el baño de agua en el extremo inferior y el calentador en el extremo superior, permiten determinar LT50 con precisión. Usando este enfoque, se podría detectar una diferencia en el límite térmico que es <1 ° C (Figu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el Fondo de Investigación de la Facultad del Swarthmore College [KC] y la beca de investigación de verano Robert Reynolds y Lucinda Lewis ’70 para BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
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