Bestemmelse af termiske grænser for dyreplankton ved hjælp af en varmeblok

Summary

Denne protokol illustrerer brugen af kommercielt tilgængelige komponenter til at generere en stabil og lineær termisk gradient. En sådan gradient kan derefter anvendes til at bestemme den øvre termiske grænse for planktoniske organismer, især hvirvelløse larver.

Abstract

Termiske grænser og bredde er blevet brugt i vid udstrækning til at forudsige artsfordelingen. Da den globale temperatur fortsætter med at stige, er det afgørende at forstå, hvordan termisk grænse ændres med akklimatisering, og hvordan den varierer mellem livsstadier og populationer, for at bestemme arternes sårbarhed over for fremtidig opvarmning. De fleste marine organismer har komplekse livscyklusser, der omfatter tidlige planktoniske stadier. Mens kvantificering af den termiske grænse for disse små tidlige udviklingsstadier (titusinder til hundreder af mikron) hjælper med at identificere udviklingsmæssige flaskehalse, kan denne proces være udfordrende på grund af den lille størrelse af målorganismer, stort bænkpladsbehov og høje indledende fabrikationsomkostninger. Her præsenteres en opsætning, der er rettet mod små mængder (ml til ti ml). Denne opsætning kombinerer kommercielt tilgængelige komponenter for at generere en stabil og lineær termisk gradient. Produktionsspecifikationer for opsætningen samt procedurer til at introducere og opregne levende versus døde individer og beregne dødelig temperatur præsenteres også.

Introduction

Termisk tolerance er nøglen til organismers overlevelse og funktion ^1,2. Da planeten fortsætter med at varme på grund af menneskeskabte kulstofemissioner, lægges der stigende vægt på bestemmelse og anvendelse af termiske grænser³. Forskellige endepunkter, såsom dødelighed, manglende udvikling og tab af mobilitet, er blevet brugt til at bestemme både øvre og nedre termiske grænser⁴. Disse termiske grænser betragtes ofte som en proxy for en organismes termiske niche. Disse oplysninger bruges igen til at identificere arter, der er mere sårbare over for global opvarmning, samt forudsige fremtidig artsfordeling og de resulterende artsinteraktioner 3,5,6,7. Det kan dog være udfordrende at bestemme termiske grænser, især for små planktoniske organismer.

For planktoniske organismer, især larvestadierne hos marine hvirvelløse dyr, kan den termiske grænse bestemmes ved kronisk eksponering. Kronisk eksponering opnås ved at opdrætte larver ved flere temperaturer over dage til uger og bestemme den temperatur, hvor larveoverlevelse og / eller udviklingshastighed reducerer ^8,9,10. Denne tilgang er imidlertid temmelig tidskrævende og kræver store inkubatorer og erfaring med larvehold (se reference¹¹ for en god introduktion til dyrkning af marine hvirvelløse larver).

Alternativt kan akut eksponering for termisk stress bruges til at bestemme termiske grænser. Ofte involverer denne bestemmelsesmetode at placere små hætteglas med larver i temperaturstyrede tørre bade 12,13,14, udnytte termiske gradientfunktioner i PCR-termiske cyklere^15,16 eller lægge glasflasker / mikrocentrifugerør langs en termisk gradient genereret ved påført opvarmning og afkøling på enderne af store aluminiumsblokke med huller, hvor hætteglassene passer tæt^{17, 18,19}. Typiske tørre bade genererer en enkelt temperatur; Derfor skal togsæt betjenes samtidigt for at vurdere ydeevnen på tværs af en række temperaturer. Termiske cyklister genererer en gradient, men rummer kun et lille prøvevolumen (120 μL) og kræver omhyggelige manipulationer. I lighed med termiske cyklister skaber store aluminiumblokke lineære og stabile temperaturgradienter. Begge tilgange kan kombineres med logistisk eller probit regression for at beregne den dødelige temperatur for 50% procent af befolkningen (LT₅₀)12,20,21. De anvendte aluminiumsblokke var imidlertid ~ 100 cm lange; Denne størrelse kræver et stort laboratorierum og adgang til specialiserede computer numeriske kontrolfræsemaskiner til at bore hullerne. Sammen med at bruge to vandbade af forskningskvalitet til at opretholde måltemperaturen, er de økonomiske omkostninger ved at samle opsætningen høje.

Derfor sigter dette arbejde mod at udvikle et alternativt middel til at generere en stabil, lineær temperaturgradient med kommercielt tilgængelige dele. Et sådant produkt skal have et lille fodaftryk og bør let kunne anvendes til forsøg med akut termisk stresseksponering for planktonorganismer. Denne protokol er udviklet med zooplankton, der er <1 mm i størrelse som målorganismer, og dermed blev den optimeret til brug af et 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugerør. Større undersøgelsesorganismer vil kræve beholdere, der er større end de 1,5 ml mikrocentrifugerør, der anvendes, og forstørrede huller i aluminiumsblokkene.

Ud over at gøre forsøgsapparatet mere tilgængeligt har dette arbejde til formål at forenkle databehandlingsrørledningen. Mens kommerciel statistisk software giver rutiner til at beregne LT₅₀ ved hjælp af logistisk eller probit regression, er licensomkostningerne ikke trivielle. Derfor vil et brugervenligt script, der er afhængig af det open source statistiske program R²² , gøre dataanalyse mere tilgængelig.

Denne protokol viser, hvordan en kompakt varmeblok kan fremstilles med kommercielt tilgængelige dele og anvendes til at udsætte zooplankton (larver af sanddollaren Dendraster excentricus) for akut varmestress for at bestemme deres øvre termiske grænse.

Protocol

1. Fremstilling af varmeblokken Tilslut 120 V, 100 W strimmelvarmeren til reostaten (se Materialetabel). Forbered aluminiumsblokken på 20,3 cm x 15,2 cm x 5 cm x 5 tommer ved at bore 60 huller i et 6 x 10 gitter (se Materialetabel). Sørg for, at hullerne er fordelt 2 cm fra centrum til centrum i begge retninger. Hver skal være 1,1 cm i diameter og 4,2 cm dyb (figur 1).BEMÆRK: Udfør boringen på en fræsemaskine e…

Representative Results

Målet med denne protokol er at bestemme den øvre termiske grænse for zooplankton. For at gøre det er der brug for en stabil og lineær termisk gradient. Den foreslåede opsætning var i stand til at generere en termisk gradient fra 14 °C til 40 °C ved at indstille vandbadstemperaturen til 8 °C og varmeapparatet til 39 °C (figur 2A). Temperaturgradienten kan indsnævres og forskydes ved at ændre slutpunktsværdierne. En termisk gradient med et smallere område (19 °C til 37 °C) ble…

Discussion

Denne protokol giver en tilgængelig og tilpasselig tilgang til at bestemme de termiske grænser for små planktonorganismer gennem akut termisk eksponering. Det 10-hullers design og fleksible temperaturendepunkter, der styres af vandbadet i den nedre ende og varmelegemet i den øvre ende, gør det muligt at bestemme LT₅₀ med præcision. Ved hjælp af denne fremgangsmåde kunne der påvises en forskel i den termiske grænse, der er <1 °C (figur 3). Denne fremgangsmåde giver en h…

Materials

0.45 µm membrane filter	VWR	74300-042
½” Acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K266	Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe	VWR	76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger	Omega Engineering	HH506A	Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette	Ranin
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W	McMaster-Carr	3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix	Pentair	CM2B	Use to make aritifical seawater
Denraster excentricus	M-Rep		Sand dollars from California
Dissecting microscope	Nikon	SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm)	Amazon		Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"	McMaster-Carr	86825K953	Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation	McMaster-Carr	4530K121	Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller	Amazon		Can be used in place of the lab-grade water bath
Example with larval sand dollar
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling	Amazon		Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet)	Amazon		Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators	VWR	89202-386	Can be replaced with an aquarium chiller
Microcentrifuge Tubes	VWR	76019-014	If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative
Nitex mesh filter	Self made		Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing
Pasteur pipette	VWR	14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)	Millpore-Sigma	P3911-500G
R statistical software.	The R Project for Statistical Computing
Syringe needle	VWR	89219-346	Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing	McMaster-Carr	5233K65	Adjust to match the chiller and block used
Zoo Med Repti Temp Rheostat	Chewy.com		Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output