Summary

Bestemmelse av termiske grenser for dyreplankton ved bruk av varmeblokk

Published: November 18, 2022
doi:

Summary

Denne protokollen illustrerer bruken av kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Slik gradient kan da brukes til å bestemme den øvre termiske grensen for planktoniske organismer, spesielt virvelløse larver.

Abstract

Termiske grenser og bredde har blitt mye brukt til å forutsi artsfordeling. Etter hvert som den globale temperaturen fortsetter å stige, er det viktig å forstå hvordan termisk grense endres med akklimatisering og hvordan den varierer mellom livsstadier og populasjoner for å bestemme artens sårbarhet for fremtidig oppvarming. De fleste marine organismer har komplekse livssykluser som inkluderer tidlige planktoniske stadier. Mens kvantifisering av den termiske grensen for disse små tidlige utviklingsstadiene (titalls til hundrevis av mikron) bidrar til å identifisere utviklingsflaskehalser, kan denne prosessen være utfordrende på grunn av den lille størrelsen på målorganismer, stort benkplassbehov og høye innledende fabrikasjonskostnader. Her presenteres et oppsett som er rettet mot små volumer (ml til titalls ml). Dette oppsettet kombinerer kommersielt tilgjengelige komponenter for å generere en stabil og lineær termisk gradient. Produksjonsspesifikasjoner for oppsettet, samt prosedyrer for å introdusere og oppregne levende versus døde individer og beregne dødelig temperatur, presenteres også.

Introduction

Termisk toleranse er nøkkelen til organismers overlevelse og funksjon 1,2. Etter hvert som planeten fortsetter å varme på grunn av menneskeskapte karbonutslipp, blir det lagt økende vekt på bestemmelse og anvendelse av termiskegrenser. Ulike endepunkter, som dødelighet, manglende utvikling og tap av mobilitet, har blitt brukt til å bestemme både øvre og nedre termiske grenser4. Disse termiske grensene betraktes ofte som en proxy for en organismes termiske nisje. Denne informasjonen brukes igjen til å identifisere arter som er mer sårbare for global oppvarming, samt forutsi fremtidig artsfordeling og de resulterende artsinteraksjonene 3,5,6,7. Imidlertid kan bestemmelse av termiske grenser, spesielt for små planktoniske organismer, være utfordrende.

For planktoniske organismer, spesielt larvestadiene til marine virvelløse dyr, kan den termiske grensen bestemmes ved kronisk eksponering. Kronisk eksponering oppnås ved å oppdrette larver ved flere temperaturer over dager til uker og bestemme temperaturen der larveoverlevelse og / eller utviklingshastighet reduserer 8,9,10. Denne tilnærmingen er imidlertid ganske tidkrevende og krever store inkubatorer og erfaring med larvehold (se referanse11 for en god innføring i dyrking av marine virvelløse larver).

Alternativt kan akutt eksponering for termisk stress brukes til å bestemme termiske grenser. Ofte innebærer denne bestemmelsesmetoden å plassere små hetteglass med larver i temperaturkontrollerte tørre bad 12,13,14, utnytte termiske gradientfunksjoner i PCR termiske syklister 15,16, eller sette glassflasker / mikrosentrifugerør langs en termisk gradient generert ved påført oppvarming og kjøling på endene av store aluminiumsblokker med hull der hetteglassene passer godt 17, 18,19. Typiske tørre bad genererer en enkelt temperatur; Derfor må flere enheter betjenes samtidig for å vurdere ytelsen over en rekke temperaturer. Termiske syklister genererer en gradient, men har bare plass til et lite prøvevolum (120 μL) og krever forsiktige manipulasjoner. I likhet med termiske syklister skaper store aluminiumsblokker lineære og stabile temperaturgradienter. Begge tilnærmingene kan kombineres med logistisk eller probit regresjon for å beregne den dødelige temperaturen for 50% prosent av befolkningen (LT50) 12,20,21. Aluminiumsblokkene som ble brukt var imidlertid ~ 100 cm lange; Denne størrelsen krever en stor laboratorieplass og tilgang til spesialiserte datamaskin numeriske kontroll fresemaskiner for å bore hullene. Sammen med å bruke to vannbad av forskningskvalitet for å opprettholde måltemperaturen, er de økonomiske kostnadene ved å montere oppsettet høye.

Derfor tar dette arbeidet sikte på å utvikle en alternativ måte å generere en stabil, lineær temperaturgradient med kommersielt tilgjengelige deler. Et slikt produkt må ha et lite fotavtrykk og skal lett kunne brukes til akutte termiske stresseksponeringseksperimenter for planktoniske organismer. Denne protokollen er utviklet med dyreplankton som er <1 mm i størrelse som målorganismer, og dermed ble den optimalisert for bruk av et 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør. Større studieorganismer vil kreve beholdere større enn de 1,5 ml mikrosentrifugerørene som brukes og forstørrede hull i aluminiumblokkene.

I tillegg til å gjøre forsøksapparatet mer tilgjengelig, har dette arbeidet som mål å forenkle databehandlingspipelinen. Mens kommersiell statistisk programvare gir rutiner for å beregne LT50 ved hjelp av logistisk eller probit regresjon, er lisenskostnaden ikke triviell. Derfor vil et brukervennlig skript som er avhengig av det statistiske programmet R22 med åpen kildekode gjøre dataanalyse mer tilgjengelig.

Denne protokollen viser hvordan en kompakt varmeblokk kan fremstilles med kommersielt tilgjengelige deler og brukes til å utsette dyreplankton (larver av sanddollaren Dendraster excentricus) for akutt varmestress for å bestemme deres øvre termiske grense.

Protocol

1. Fabrikasjon av varmeblokken Koble 120 V, 100 W stripevarmeren til reostat (se Materialtabell). Forbered aluminiumblokken på 20,3 cm x 15,2 x 5 cm (8 tommer x 5 tommer x 2 tommer) ved å bore 60 hull i et rutenett på 6 x 10 (se materialtabell). Sørg for at hullene er fordelt 2 cm fra senter til senter i begge retninger. Hver skal være 1,1 cm i diameter og 4,2 cm dyp (figur 1).MERK: Utfør boringen på en fresema…

Representative Results

Målet med denne protokollen er å bestemme den øvre termiske grensen for dyreplankton. For å gjøre dette er det nødvendig med en stabil og lineær termisk gradient. Det foreslåtte oppsettet var i stand til å generere en termisk gradient fra 14 ° C til 40 ° C ved å sette vannbadtemperaturen til 8 ° C og varmeren til 39 ° C (figur 2A). Temperaturgradienten kan innsnevres og forskyves ved å endre endepunktverdiene. En termisk gradient med et smalere område (19 °C til 37 °C) ble …

Discussion

Denne protokollen gir en tilgjengelig og tilpassbar tilnærming for å bestemme de termiske grensene for små planktonorganismer gjennom akutt termisk eksponering. 10-hulls design og fleksible temperaturendepunkter, styrt av vannbadet i den nedre enden og varmeren i den øvre enden, gjør det mulig å bestemme LT50 med presisjon. Ved hjelp av denne tilnærmingen kunne det påvises en forskjell i den termiske grensen som er <1 °C (figur 3). Denne tilnærmingen gir en rask bestemme…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet støttes av fakultetets forskningsfond ved Swarthmore College [KC] og Robert Reynolds og Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship for BJ.

Materials

0.45 µm membrane filter VWR 74300-042
½” Acrylic sheet McMaster-Carr 8560K266 Used to construct a ridged case with sufficient insulation.
1 mL syringe VWR 76290-420
2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger Omega Engineering HH506A Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube
Automatic pipette  Ranin 
Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater
with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W
McMaster-Carr 3619K32
Crystal Sea Bioassay Mix Pentair CM2B Use to make aritifical seawater 
Denraster excentricus M-Rep  Sand dollars from California 
Dissecting microscope  Nikon  SMZ645
DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) Amazon Connects to water bath and used to cool one end of the block.
Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8"  McMaster-Carr 86825K953 Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes.
Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation McMaster-Carr 4530K121 Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature 
EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller Amazon Can be used in place of the lab-grade water bath 
Example with larval sand dollar 
GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling Amazon Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements.
Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) Amazon Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range
Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators VWR 89202-386 Can be replaced with an aquarium chiller 
Microcentrifuge Tubes VWR 76019-014 If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative 
Nitex mesh filter  Self made Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing 
Pasteur pipette VWR 14673-010
Potassium Chloride (0.35 M)  Millpore-Sigma P3911-500G
R statistical software.  The R Project for Statistical Computing
Syringe needle VWR 89219-346 Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used
Tygon Tubing  McMaster-Carr 5233K65 Adjust to match the chiller and block used 
Zoo Med Repti Temp Rheostat Chewy.com Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output

References

  1. Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
  2. García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
  3. Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
  4. Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
  5. Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
  6. Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
  7. Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
  8. Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
  9. Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
  10. Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
  11. Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
  12. Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
  13. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
  14. Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
  15. Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
  16. Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
  17. Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
  18. Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
  19. Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
  20. Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
  21. Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
  22. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
  23. Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
  24. Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
  25. Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
  26. Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
  27. Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
  28. Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
  29. Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
check_url/64762?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Chan, K. Y. K., Jorgensen, B. K., Scoma, S. Thermal Limits Determination for Zooplankton Using a Heat Block. J. Vis. Exp. (189), e64762, doi:10.3791/64762 (2022).

View Video