Bestämning av termiska gränser för djurplankton med hjälp av ett värmeblock
Summary
Detta protokoll illustrerar användningen av kommersiellt tillgängliga komponenter för att generera en stabil och linjär termisk gradient. En sådan gradient kan sedan användas för att bestämma den övre termiska gränsen för planktoniska organismer, särskilt ryggradslösa larver.
Abstract
Termiska gränser och bredd har använts i stor utsträckning för att förutsäga artfördelning. När den globala temperaturen fortsätter att stiga är det viktigt att förstå hur termisk gräns förändras med acklimatisering och hur den varierar mellan livsstadier och populationer för att bestämma arternas sårbarhet för framtida uppvärmning. De flesta marina organismer har komplexa livscykler som inkluderar tidiga planktoniska stadier. Även om kvantifiering av den termiska gränsen för dessa små tidiga utvecklingsstadier (tiotals till hundratals mikron) hjälper till att identifiera flaskhalsar i utvecklingen, kan denna process vara utmanande på grund av målorganismernas lilla storlek, stora bänkutrymmeskrav och höga initiala tillverkningskostnader. Här presenteras en inställning som är inriktad på små volymer (ml till tiotals ml). Denna inställning kombinerar kommersiellt tillgängliga komponenter för att generera en stabil och linjär termisk gradient. Produktionsspecifikationer för installationen, liksom procedurer för att introducera och räkna upp levande kontra döda individer och beräkna dödlig temperatur, presenteras också.
Introduction
Termisk tolerans är nyckeln till organismers överlevnad och funktion 1,2. När planeten fortsätter att värmas på grund av antropogena koldioxidutsläpp ägnas allt större uppmärksamhet åt bestämning och tillämpning av termiska gränser3. Olika slutpunkter, såsom dödlighet, utvecklingsmisslyckande och förlust av rörlighet, har använts för att bestämma både övre och nedre termiska gränser4. Dessa termiska gränser anses ofta vara en proxy för en organisms termiska nisch. Denna information används i sin tur för att identifiera arter som är mer sårbara för global uppvärmning, samt förutsäga framtida artfördelning och de resulterande artinteraktionerna 3,5,6,7. Att bestämma termiska gränser, särskilt för små planktoniska organismer, kan dock vara utmanande.
För planktoniska organismer, särskilt larvstadierna hos marina ryggradslösa djur, kan den termiska gränsen bestämmas genom kronisk exponering. Kronisk exponering uppnås genom uppfödning av larver vid flera temperaturer under dagar till veckor och genom att bestämma temperaturen vid vilken larvöverlevnad och/eller utvecklingshastighet minskarmed 8,9,10. Detta tillvägagångssätt är dock ganska tidskrävande och kräver stora inkubatorer och erfarenhet av larvhållning (se referens11 för en bra introduktion till odling av marina ryggradslösa larver).
Alternativt kan akut exponering för termisk stress användas för att bestämma termiska gränser. Ofta innebär denna bestämningsmetod att man placerar små injektionsflaskor med larver i temperaturkontrollerade torra bad 12,13,14, utnyttjar termiska gradientfunktioner i PCR-termiska cykler 15,16, eller sätter glasflaskor/mikrocentrifugrör längs en termisk gradient som genereras genom applicerad uppvärmning och kylning i ändarna av stora aluminiumblock med hål där injektionsflaskorna sitter tätt 17, 18,19. Typiska torra bad genererar en enda temperatur; Därför måste flera enheter drivas samtidigt för att bedöma prestanda över ett temperaturintervall. Termiska cykler genererar en gradient men rymmer endast en liten provvolym (120 μL) och kräver noggranna manipuleringar. I likhet med termiska cykler skapar stora aluminiumblock linjära och stabila temperaturgradienter. Båda metoderna kan kombineras med logistisk eller probitregression för att beräkna den dödliga temperaturen för 50% procent av befolkningen (LT50)12,20,21. De använda aluminiumblocken var dock ~ 100 cm långa; Denna storlek kräver ett stort labbutrymme och tillgång till specialiserade dator numeriska styrfräsmaskiner för att borra hålen. Tillsammans med att använda två vattenbad av forskningskvalitet för att bibehålla måltemperaturen är den ekonomiska kostnaden för att montera installationen hög.
Därför syftar detta arbete till att utveckla ett alternativt sätt att generera en stabil, linjär temperaturgradient med kommersiellt tillgängliga delar. En sådan produkt måste ha ett litet fotavtryck och bör lätt kunna användas för akuta termiska spänningsexponeringsexperiment för planktoniska organismer. Detta protokoll är utvecklat med djurplankton som är <1 mm stort som målorganismer, och därmed optimerades det för användning av ett 1,5 eller 2 ml mikrocentrifugrör. Större studieorganismer kommer att kräva behållare som är större än de 1,5 ml mikrocentrifugrör som används och förstorade hål i aluminiumblocken.
Förutom att göra experimentapparaten mer tillgänglig syftar detta arbete till att förenkla databehandlingsrörledningen. Medan kommersiell statistisk programvara tillhandahåller rutiner för att beräkna LT50 med hjälp av logistisk eller probit-regression, är licenskostnaden icke-trivial. Därför skulle ett lättanvänt skript som förlitar sig på det statistiska programmet R22 med öppen källkod göra dataanalysen mer tillgänglig.
Detta protokoll visar hur ett kompakt värmeblock kan tillverkas med kommersiellt tillgängliga delar och appliceras för att utsätta djurplankton (larver av sanddollarn Dendraster excentricus) för akut värmestress för att bestämma deras övre termiska gräns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger ett tillgängligt och anpassningsbart tillvägagångssätt för att bestämma de termiska gränserna för små planktonorganismer genom akut termisk exponering. 10-hålsdesignen och flexibla temperaturslutpunkter, som styrs av vattenbadet i nedre änden och värmaren i den övre änden, gör det möjligt för en att bestämma LT50 med precision. Med hjälp av detta tillvägagångssätt kan en skillnad i den termiska gränsen som är <1 °C detekteras (figur 3)….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av fakultetsforskningsfonden vid Swarthmore College [KC] och Robert Reynolds och Lucinda Lewis ’70 Summer Research Fellowship för BJ.
Materials
| 0.45 µm membrane filter | VWR | 74300-042 | |
| ½” Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K266 | Used to construct a ridged case with sufficient insulation. |
| 1 mL syringe | VWR | 76290-420 | |
| 2 Channel 7 Thermocouple Types Datalogger | Omega Engineering | HH506A | Can be replaced with any thermometer that will fit inside a microcentrifuge tube |
| Automatic pipette | Ranin | ||
| Bolt- and Clamp-Mount Strip Heater with 430 Stainless Steel Sheath, 120V AC, 1-1/2" Wide, 100W |
McMaster-Carr | 3619K32 | |
| Crystal Sea Bioassay Mix | Pentair | CM2B | Use to make aritifical seawater |
| Denraster excentricus | M-Rep | Sand dollars from California | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ645 | |
| DIYhz Aluminum Water Cooling Block, Liquid Water Cooler Heat Sink System for PC Computer CPU Graphics Radiator Heatsink Endothermic Head Silver(40 mm x 120 mm x 12 mm) | Amazon | Connects to water bath and used to cool one end of the block. | |
| Easy-to-Machine MIC6 Cast Aluminum Sheet 2" thick 8" x 8" | McMaster-Carr | 86825K953 | Machined to 2" x 6" x 8" with 60 equally spaced holes (11 mm dia., 42 mm depth) with two addition holes drilled in one side for thermostat probes. |
| Economical Flexible Polyethylene Foam Pipe Insulation | McMaster-Carr | 4530K121 | Covers the plastic tubing between chiller and block to reduce heat loss. Can be omitted if temperature range is close to room temperature |
| EVERSECU 72w 110-240v Aquarium Water Chiller Warmer/Cooler Temperature Controller for Fish Shrimp Tank Marine Coral Reef Tank Below 20 L/30 L Aquarium Chiller | Amazon | Can be used in place of the lab-grade water bath | |
| Example with larval sand dollar | |||
| GENNEL 100 g Silver Silicone Thermal Conductive Compound Grease Paste For GPU CPU IC LED Ovens Cooling | Amazon | Improves the thermal conductance between the block and the heating and cooling elements. | |
| Inkbird WiFi Reptile Thermostat Temperature Controller with 2 Probes and 2 Outlets, IPT-2CH Reptiles Heat Mat Thermostat (Max 250 W per Outlet) | Amazon | Monitors hot and cold ends. Maintains hot end in range | |
| Lauda Ecoline Silver Air-Cooled Refrigerated Circulators | VWR | 89202-386 | Can be replaced with an aquarium chiller |
| Microcentrifuge Tubes | VWR | 76019-014 | If larger animals are used, scanilation vials (VWR 66022-004) is a good alternative |
| Nitex mesh filter | Self made | Used hot glue to attached Nitex mesh to 1/2" PVC tubing | |
| Pasteur pipette | VWR | 14673-010 | |
| Potassium Chloride (0.35 M) | Millpore-Sigma | P3911-500G | |
| R statistical software. | The R Project for Statistical Computing | ||
| Syringe needle | VWR | 89219-346 | Depending on size of target organism gague 14 and 16 can be used |
| Tygon Tubing | McMaster-Carr | 5233K65 | Adjust to match the chiller and block used |
| Zoo Med Repti Temp Rheostat | Chewy.com | Rated to 150 W and rewired to feed directly into the heating element. Used to control rate of heat output |
References
- Dowd, W. W., King, F. A., Denny, M. W. Thermal variation, thermal extremes and the physiological performance of individuals. Journal of Experimental Biology. 218 (12), 1956-1967 (2015).
- García, F. C., Bestion, E., Warfield, R., Yvon-Durocher, G. Changes in temperature alter the relationship between biodiversity and ecosystem functioning. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (43), 10989-10994 (2018).
- Sinclair, B. J., et al. Can we predict ectotherm responses to climate change using thermal performance curves and body temperatures. Ecology Letters. 19 (11), 1372-1385 (2016).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Canadian Journal of Zoology. 75 (10), 1561-1574 (1997).
- Bennett, J. M., et al. The evolution of critical thermal limits of life on Earth. Nature Communications. 12 (1), 1198 (2021).
- Sunday, J. M., Bates, A. E., Dulvy, N. K. Thermal tolerance and the global redistribution of animals. Nature Climate Change. 2 (9), 686-690 (2012).
- Deutsch, C. A., et al. Impacts of climate warming on terrestrial ectotherms across latitude. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (18), 6668-6672 (2008).
- Collin, R., Chan, K. Y. K. The sea urchin Lytechinus variegatus lives close to the upper thermal limit for early development in a tropical lagoon. Ecology and Evolution. 6 (16), 5623-5634 (2016).
- Wang, W., Ding, M. -. w., Li, X. -. x., Wang, J., Dong, Y. -. w. Divergent thermal sensitivities among different life stages of the pulmonate limpet Siphonaria japonica. Marine Biology. 164 (6), 1-10 (2017).
- Mak, K. K. -. Y., Chan, K. Y. K. Interactive effects of temperature and salinity on early life stages of the sea urchin Heliocidaris crassispina. Marine Biology. 165 (3), 1-11 (2018).
- Strathmann, R. R. Culturing larva of marine invertebrates. Developmental Biology of the Sea Urchin and Other Marine Invertebrates. , 1-25 (2014).
- Stillman, J. H., Somero, G. N. A comparative analysis of the upper thermal tolerance limits of Eastern Pacific porcelain crabs, Genus Petrolisthes: Influences of latitude, vertical Zonation, acclimation, and phylogeny. Physiological and Biochemical Zoology. 73 (2), 200-208 (2000).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Integrating patterns of thermal tolerance and phenotypic plasticity with population genetics to improve understanding of vulnerability to warming in a widespread copepod. Global Change Biology. 25 (12), 4147-4164 (2019).
- Sasaki, M. C., Dam, H. G. Genetic differentiation underlies seasonal variation in thermal tolerance, body size, and plasticity in a short-lived copepod. Ecology and Evolution. 10 (21), 12200-12210 (2020).
- Kelly, M. W., Sanford, E., Grosberg, R. K. Limited potential for adaptation to climate change in a broadly distributed marine crustacean. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1727), 349-356 (2012).
- Rivera, H. E., Chen, C. -. Y., Gibson, M. C., Tarrant, A. M. Plasticity in parental effects confers rapid larval thermal tolerance in the estuarine anemone Nematostella vectensis. Journal of Experimental Biology. 224 (5), 236745 (2021).
- Sewell, M. A., Young, C. M. Temperature limits to fertilization and early development in the tropical sea urchin Echinometra lucunter. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 236 (2), 291-305 (1999).
- Walther, K., Crickenberger, S. E., Marchant, S., Marko, P. B., Moran, A. L. Thermal tolerance of larvae of Pollicipes elegans, a marine species with an antitropical distribution. Marine Biology. 160 (10), 2723-2732 (2013).
- Byrne, M., Gall, M. L., Campbell, H., Lamare, M. D., Holmes, S. P. Staying in place and moving in space: contrasting larval thermal sensitivity explains distributional changes of sympatric sea urchin species to habitat warming. Global Change Biology. 28 (9), 3040-3053 (2022).
- Zippay, M. L., Hofmann, G. E. Physiological tolerances across latitudes: thermal sensitivity of larval marine snails (Nucella spp). Marine Biology. 157 (4), 707-714 (2010).
- Collin, R., Rebolledo, A. P., Smith, E., Chan, K. Y. K. Thermal tolerance of early development predicts the realized thermal niche in marine ectotherms. Functional Ecology. 35 (8), 1679-1692 (2021).
- R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2021).
- Venables, W. N., Ripley, B. D. . Modern Applied Statistics with S-PLUS. Fourth edn. , (2002).
- Fumo, J. T., et al. Contextualizing marine heatwaves in the southern California bight under anthropogenic climate change. Journal of Geophysical Research: Oceans. 125 (5), (2020).
- Wheeler, M. W., Park, R. M., Bailer, A. J. Comparing median lethal concentration values using confidence interval overlap or ratio tests. Environmental Toxicology and Chemistry: An International Journal. 25 (5), 1441-1444 (2006).
- Kingsolver, J. G., MacLean, H. J., Goddin, S. B., Augustine, K. E. Plasticity of upper thermal limits to acute and chronic temperature variation in Manduca sexta larvae. Journal of Experimental Biology. 219 (9), 1290-1294 (2016).
- Kuo, E. S. L., Sanford, E. Geographic variation in the upper thermal limits of an intertidal snail: implications for climate envelope models. Marine Ecology Progress Series. 388, 137-146 (2009).
- Hammond, L. M., Hofmann, G. E. Thermal tolerance of Strongylocentrotus purpuratus early life history stages: mortality, stress-induced gene expression and biogeographic patterns. Marine biology. 157 (12), 2677-2687 (2010).
- Sasaki, M., Dam, H. G. Global patterns in copepod thermal tolerance. Journal of Plankton Research. 43 (4), 598-609 (2021).
