I denne protokol blev metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) optimeret til parret forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved hjælp af NuTRAP-musemodellen krydset til en Cyp17a1-Cre-muselinje.
Vurdering af celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer er nøglen til forståelse af æggestokkenes aldring. Til dette formål blev optimeringen af metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) metode udført til den efterfølgende parrede forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved anvendelse af en ny transgen NuTRAP-musemodel. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i kørsel af for tidlige aldringsfænotyper, blev NuTRAP-ekspressionssystemet målrettet mod stromale celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Induktionen af NuTRAP-konstruktionen var specifik for ovariestromale fibroblaster, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser blev opnået fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med en tilgængelig Cre-linje.
Æggestokkene er vigtige aktører i somatisk aldring1, med forskellige bidrag fra specifikke cellepopulationer. Den cellulære heterogenitet af æggestokken gør det vanskeligt at fortolke molekylære resultater fra bulk, hel-ovarie assays. Forståelse af specifikke cellepopulationers rolle i æggestokkenes aldring er nøglen til at identificere de molekylære drivere, der er ansvarlige for fertilitet og sundhedsnedgang hos ældre kvinder. Traditionelt blev multi-omics-vurderingen af specifikke ovariecelletyper opnået ved teknikker som lasermikrodissektion2, enkeltcellemetoder3 eller cellesortering4. Imidlertid kan mikrodissektion være dyrt og vanskeligt at udføre, og cellesortering kan ændre cellulære fænotypiske profiler5.
En ny tilgang til vurdering af ovariecelletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske profiler bruger den nukleare mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) musemodel. NuTRAP-modellen tillader isolering af celletypespecifikke nukleinsyrer uden behov for cellesortering ved hjælp af affinitetsrensningsmetoderne: oversættelse af ribosomaffinitetsoprensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT)6. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Ved at krydse NuTRAP-musen med en celletypespecifik Cre-linje forårsager fjernelsen af STOP-kassetten eGFP-mærkning af det ribosomale kompleks og biotin/mCherry-tagging af kernen på en Cre-afhængig måde6. TRAP- og INTACT-teknikkerne kan derefter bruges til at isolere mRNA og nukleært DNA fra den pågældende celletype og gå videre til transkriptomiske og epigenomiske analyser.
NuTRAP-modellen er blevet brugt i forskellige væv, såsom fedtvæv6, hjernevæv 7,8,9 og nethinden 10, til at afsløre celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer, der muligvis ikke påvises i helvævshomogenat. Fordelene ved NuTRAP-tilgangen i forhold til traditionelle cellesorteringsteknikker inkluderer følgende: 1) forebyggelse af ex vivo-aktiveringsartefakter 8, 2) det minimerede behov for specialudstyr (dvs. cellesorterere) og 3) den øgede gennemstrømning og reducerede omkostninger ved celletypespecifikke analyser. Derudover giver evnen til at isolere celletypespecifikt DNA og RNA fra en enkelt mus mulighed for parrede analyser, der øger den statistiske styrke. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i at køre for tidlige aldringsfænotyper 11,12,13, målrettede vi NuTRAP-ekspressionssystemet til stromale og theca-celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Her demonstrerer vi, at induktionen af NuTRAP-konstruktionen er specifik for ovariestromale og thecaceller, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser opnås fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med enhver tilgængelig Cre-linje.
Til generering af en celletypespecifik NuTRAP-muselinje i æggestokkene har NuTRAP-allelen til nuklear mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) et floxed STOP-kodon, der styrer ekspressionen af BirA, biotinligasegenkendelsespeptid (BLRP)-mærket mCherry/mRANGAP1 og eGFP/L10a. Når NuTRAP-kassetten krydses med en celletypespecifik Cre-linje, mærker ekspressionen af NuTRAP-kassetten det nukleare protein mRANGAP1 med biotin/mCherry og ribosomalt protein L10a med eGFP på en Cre-afhængig måde. Dette muliggør isolering af kerner og mRNA fra specifikke celletyper uden behov for cellesortering. NuTRAP flox/flox kan parres med en celletypespecifik Cre, der er relevant for ovariecelletyper for at vurdere dette.
NuTRAP-musemodel6 er en kraftfuld transgen mærkningsmetode til parret forhør af transkriptomet og epigenomet fra specifikke celletyper, der kan tilpasses enhver celletype med en tilgængelig Cre-driver. Her demonstrerer vi specificiteten af Cyp17-NuTRAP-musemodellen til målretning af ovarie-theca- og stromale celler. Cyp17-NuTRAP-modellen kan bruges til yderligere at belyse de theca- og stromale cellespecifikke epigenetiske mekanismer, der er involveret i æggestokkenes aldring, kræft og sygdo…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) og Presbyterian Health Foundation. Dette arbejde blev også delvist støttet af MERIT-prisen I01BX003906 og en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) -pris ISIBX004797 fra USA (USA) Institut for Veterananliggender, Biomedicinsk Laboratorium Forskning og Udvikling Service. Forfatterne vil også gerne takke Clinical Genomics Center (OMRF) og Imaging Core Facility (OMRF) for hjælp og instrumentbrug.
0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |