Cellespecifik parret forhør af musens ovarieepigenom og transkriptom
Summary
I denne protokol blev metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) optimeret til parret forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved hjælp af NuTRAP-musemodellen krydset til en Cyp17a1-Cre-muselinje.
Abstract
Vurdering af celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer er nøglen til forståelse af æggestokkenes aldring. Til dette formål blev optimeringen af metoden til oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT) metode udført til den efterfølgende parrede forhør af det cellespecifikke ovarietranskriptom og epigenom ved anvendelse af en ny transgen NuTRAP-musemodel. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i kørsel af for tidlige aldringsfænotyper, blev NuTRAP-ekspressionssystemet målrettet mod stromale celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Induktionen af NuTRAP-konstruktionen var specifik for ovariestromale fibroblaster, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser blev opnået fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med en tilgængelig Cre-linje.
Introduction
Æggestokkene er vigtige aktører i somatisk aldring1, med forskellige bidrag fra specifikke cellepopulationer. Den cellulære heterogenitet af æggestokken gør det vanskeligt at fortolke molekylære resultater fra bulk, hel-ovarie assays. Forståelse af specifikke cellepopulationers rolle i æggestokkenes aldring er nøglen til at identificere de molekylære drivere, der er ansvarlige for fertilitet og sundhedsnedgang hos ældre kvinder. Traditionelt blev multi-omics-vurderingen af specifikke ovariecelletyper opnået ved teknikker som lasermikrodissektion2, enkeltcellemetoder3 eller cellesortering4. Imidlertid kan mikrodissektion være dyrt og vanskeligt at udføre, og cellesortering kan ændre cellulære fænotypiske profiler5.
En ny tilgang til vurdering af ovariecelletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske profiler bruger den nukleare mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) musemodel. NuTRAP-modellen tillader isolering af celletypespecifikke nukleinsyrer uden behov for cellesortering ved hjælp af affinitetsrensningsmetoderne: oversættelse af ribosomaffinitetsoprensning (TRAP) og isolering af kerner mærket i specifikke celletyper (INTACT)6. Ekspressionen af NuTRAP-allelen er under kontrol af en floxed STOP-kassette og kan målrettes mod specifikke ovariecelletyper ved hjælp af promotorspecifikke Cre-linjer. Ved at krydse NuTRAP-musen med en celletypespecifik Cre-linje forårsager fjernelsen af STOP-kassetten eGFP-mærkning af det ribosomale kompleks og biotin/mCherry-tagging af kernen på en Cre-afhængig måde6. TRAP- og INTACT-teknikkerne kan derefter bruges til at isolere mRNA og nukleært DNA fra den pågældende celletype og gå videre til transkriptomiske og epigenomiske analyser.
NuTRAP-modellen er blevet brugt i forskellige væv, såsom fedtvæv6, hjernevæv 7,8,9 og nethinden 10, til at afsløre celletypespecifikke epigenomiske og transkriptomiske ændringer, der muligvis ikke påvises i helvævshomogenat. Fordelene ved NuTRAP-tilgangen i forhold til traditionelle cellesorteringsteknikker inkluderer følgende: 1) forebyggelse af ex vivo-aktiveringsartefakter 8, 2) det minimerede behov for specialudstyr (dvs. cellesorterere) og 3) den øgede gennemstrømning og reducerede omkostninger ved celletypespecifikke analyser. Derudover giver evnen til at isolere celletypespecifikt DNA og RNA fra en enkelt mus mulighed for parrede analyser, der øger den statistiske styrke. Da nylige undersøgelser har impliceret stromale celler i æggestokkene i at køre for tidlige aldringsfænotyper 11,12,13, målrettede vi NuTRAP-ekspressionssystemet til stromale og theca-celler ved hjælp af en Cyp17a1-Cre-driver. Her demonstrerer vi, at induktionen af NuTRAP-konstruktionen er specifik for ovariestromale og thecaceller, og tilstrækkeligt DNA og RNA til sekventeringsundersøgelser opnås fra en enkelt æggestok. NuTRAP-modellen og metoderne, der præsenteres her, kan bruges til at studere enhver ovariecelletype med enhver tilgængelig Cre-linje.
Til generering af en celletypespecifik NuTRAP-muselinje i æggestokkene har NuTRAP-allelen til nuklear mærkning og oversættelse af ribosomaffinitetsrensning (NuTRAP) et floxed STOP-kodon, der styrer ekspressionen af BirA, biotinligasegenkendelsespeptid (BLRP)-mærket mCherry/mRANGAP1 og eGFP/L10a. Når NuTRAP-kassetten krydses med en celletypespecifik Cre-linje, mærker ekspressionen af NuTRAP-kassetten det nukleare protein mRANGAP1 med biotin/mCherry og ribosomalt protein L10a med eGFP på en Cre-afhængig måde. Dette muliggør isolering af kerner og mRNA fra specifikke celletyper uden behov for cellesortering. NuTRAP flox/flox kan parres med en celletypespecifik Cre, der er relevant for ovariecelletyper for at vurdere dette.
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAP-musemodel6 er en kraftfuld transgen mærkningsmetode til parret forhør af transkriptomet og epigenomet fra specifikke celletyper, der kan tilpasses enhver celletype med en tilgængelig Cre-driver. Her demonstrerer vi specificiteten af Cyp17-NuTRAP-musemodellen til målretning af ovarie-theca- og stromale celler. Cyp17-NuTRAP-modellen kan bruges til yderligere at belyse de theca- og stromale cellespecifikke epigenetiske mekanismer, der er involveret i æggestokkenes aldring, kræft og sygdo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) og Presbyterian Health Foundation. Dette arbejde blev også delvist støttet af MERIT-prisen I01BX003906 og en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) -pris ISIBX004797 fra USA (USA) Institut for Veterananliggender, Biomedicinsk Laboratorium Forskning og Udvikling Service. Forfatterne vil også gerne takke Clinical Genomics Center (OMRF) og Imaging Core Facility (OMRF) for hjælp og instrumentbrug.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
