Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Interrogación pareada específica de células del epigenoma ovárico y transcriptoma de ratón

Published: February 24, 2023 doi: 10.3791/64765
Automatic Translation
*1,2,3, *1,3, 1, 2, 2, 4, 2,3, 1,3
1Aging and Metabolism Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 2Genes & Human Disease Research Program, Oklahoma Medical Research Foundation, 3Oklahoma City Veterans Affairs Medical Center, 4Nutrition College, Federal University of Pelotas
* These authors contributed equally

Summary

En este protocolo, el método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) se optimizaron para la interrogación pareada del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando el modelo de ratón NuTRAP cruzado a una línea de ratón Cyp17a1-Cre.

Abstract

La evaluación de los cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular es clave para comprender el envejecimiento ovárico. Con este fin, se realizó la optimización del método de purificación de afinidad ribosómica por traducción (TRAP) y el método de aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT) para el posterior interrogatorio pareado del transcriptoma ovárico específico de células y el epigenoma utilizando un nuevo modelo de ratón NuTRAP transgénico. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de fenotipos de envejecimiento prematuro, el sistema de expresión NuTRAP se dirigió a las células del estroma utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. La inducción de la construcción NuTRAP fue específica para los fibroblastos del estroma ovárico, y se obtuvo suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con una línea Cre disponible.

Introduction

Los ovarios son actores importantes en el envejecimiento somático1, con distintas contribuciones de poblaciones celulares específicas. La heterogeneidad celular del ovario dificulta la interpretación de los resultados moleculares de los ensayos masivos de ovario completo. Comprender el papel de poblaciones celulares específicas en el envejecimiento ovárico es clave para identificar los impulsores moleculares responsables de la fertilidad y el deterioro de la salud en mujeres de edad avanzada. Tradicionalmente, la evaluación multiómica de tipos específicos de células ováricas se lograba mediante técnicas como la microdisección láser2, los enfoques unicelulares3 o la clasificación celular4. Sin embargo, la microdisección puede ser costosa y difícil de realizar, y la clasificación celular puede alterar los perfiles fenotípicos celulares5.

Un enfoque novedoso para evaluar los perfiles epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo de células ováricas utiliza el modelo de ratón de purificación de afinidad de ribosomas de etiquetado nuclear y traducción (NuTRAP). El modelo NuTRAP permite el aislamiento de ácidos nucleicos específicos del tipo celular sin necesidad de clasificación celular mediante el uso de los métodos de purificación de afinidad: purificación de afinidad ribosómica traducida (TRAP) y aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACT)6. La expresión del alelo NuTRAP está bajo el control de un casete STOP floxed y puede dirigirse a tipos específicos de células ováricas utilizando líneas Cre específicas del promotor. Al cruzar el ratón NuTRAP con una línea Cre específica del tipo celular, la eliminación del casete STOP provoca el marcado eGFP del complejo ribosómico y el marcado biotina/mCherry del núcleo de una manera dependiente de Cre6. Las técnicas TRAP e INTACT se pueden utilizar para aislar el ARNm y el ADN nuclear del tipo de célula de interés y proceder a análisis transcriptómicos y epigenómicos.

El modelo NuTRAP se ha utilizado en diferentes tejidos, como el tejido adiposo6, el tejido cerebral 7,8,9 y la retina10, para revelar cambios epigenómicos y transcriptómicos específicos del tipo celular que pueden no detectarse en el homogeneizado de todo el tejido. Los beneficios del enfoque NuTRAP sobre las técnicas tradicionales de clasificación celular incluyen lo siguiente: 1) la prevención de artefactos de activación ex vivo 8, 2) la necesidad minimizada de equipos especializados (es decir, clasificadores celulares) y 3) el aumento del rendimiento y la disminución del costo de los análisis específicos del tipo de célula. Además, la capacidad de aislar ADN y ARN específicos del tipo de célula de un solo ratón permite análisis pareados que aumentan el poder estadístico. Dado que estudios recientes han implicado a las células del estroma ovárico en la conducción de los fenotipos de envejecimiento prematuro 11,12,13, dirigimos el sistema de expresión NuTRAP a las células del estroma y la teca utilizando un controlador Cyp17a1-Cre. Aquí, demostramos que la inducción de la construcción NuTRAP es específica para las células del estroma ovárico y la teca, y se obtiene suficiente ADN y ARN para los estudios de secuenciación de un solo ovario. El modelo NuTRAP y los métodos presentados aquí se pueden utilizar para estudiar cualquier tipo de célula ovárica con cualquier línea Cre disponible.

Para la generación de una línea de ratón NuTRAP ovárico específica para el tipo celular, el alelo de purificación de afinidad de ribosomas de marcado nuclear y traducción (NuTRAP) tiene un codón STOP floxado que controla la expresión de BirA, mCherry/mRANGAP1 marcado con el péptido de reconocimiento de biotina ligasa (BLRP) y eGFP/L10a. Cuando se cruza con una línea Cre específica del tipo celular, la expresión del casete NuTRAP marca la proteína nuclear mRANGAP1 con biotina/mCherry y la proteína ribosómica L10a con eGFP de una manera dependiente de Cre. Esto permite el aislamiento de núcleos y ARNm de tipos celulares específicos sin necesidad de clasificación celular. El NuTRAP flox/flox se puede emparejar con un Cre específico del tipo de célula relevante para los tipos de células ováricas para evaluar esto.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Fundación de Investigación Médica de Oklahoma (OMRF). Los ratones parentales fueron comprados en el Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y criados y alojados en condiciones de SPF en un ambiente de barrera HEPA en un ciclo de luz / oscuridad de 14 h / 10 h (luces encendidas a las 6:00 am) en el OMRF.

NOTA: En esta demostración, utilizamos un macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparejado con una hembra NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). La progenie Cyp17-NuTRAP deseada (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) expresará el alelo NuTRAP bajo el control del promotor Cyp17a1 en las células del estroma ovárico. Para la preparación de este manuscrito, utilizamos ratones hembra Cyp17-NuTRAP de 4 meses de edad (n = 4). Se extrajo ADN de muestras de perforación de orejas de ratón para genotipado para confirmar la herencia de los transgenes Cyp17iCre y NuTRAP y para la detección por PCR de 1) Cre genérico, 2) Cyp17iCre y 3) NuTRAP floxed utilizando los cebadores enumerados en la Tabla de materiales, como se describió anteriormente 7,8.

1. Disección ovárica con ratón

  1. Realizar la eutanasia del ratón de acuerdo con las pautas de cuidado de los animales y la aprobación de la institución, seguida de la recolección de ovarios.
  2. Diseccionar los ovarios para eliminar cualquier tejido adiposo o partes de los oviductos que puedan estar unidos al tejido ovárico antes de colocar los ovarios en tubos con tampón. Proceda inmediatamente a las técnicas TRAP o INTACT.
    NOTA: Este protocolo no ha sido optimizado para su uso con tejido congelado. Se recomienda el uso de un ovario del mismo ratón para cada técnica para futuros análisis estadísticos.

2. Aislamiento de núcleos de tipos específicos de células ováricas

  1. Preparación del tampón
    1. Tampón de purificación nuclear (NPB): Para preparar 100 mL de NPB, combine 2 mL de 1 M HEPES (concentración final: 20 mM HEPES), 0.8 mL de 5 M NaCl (40 mM NaCl), 4.5 mL de 2 M KCl (90 mM KCl), 0.4 mL de 0.5 M EDTA (2 mM EDTA), 0.1 mL de 0.5 M EGTA (0.5 mM EGTA), y 92,2 ml de agua libre de nucleasas. Suplemento con 1x inhibidor de la proteasa el día del aislamiento de núcleos.
      NOTA: NPB se puede preparar sin el inhibidor de la proteasa por adelantado y dura hasta 3 semanas a 4 °C.
    2. Tampón de lisis de núcleos (completo): Complementa el tampón de lisis de núcleos con 1x inhibidor de proteasa el día del aislamiento de núcleos.
  2. Creación de la suspensión de núcleos
    NOTA: Las muestras deben mantenerse en hielo en todo momento a menos que se indique lo contrario.
    1. Recolectar un ovario de un ratón Cyp17-NuTRAP (u otro Cre-NuTRAP relevante) en 500 μL de tampón de lisis de núcleos (completo). Picar el ovario en ocho partes dentro del tampón con microtijeras de apertura automática.
    2. Use puntas de pipeta de diámetro ancho para transferir el ovario picado y 500 μL de tampón de lisis a un homogeneizador de vidrio Rebote en hielo. Homogeneizar el ovario 10x-20x con el mortero suelto A. Añadir 400 μL de tampón de lisis al homogeneizador Dounce, lavando el mortero A.
    3. Homogeneizar el ovario con el mortero apretado B 10x-20x. Añadir 1.000 μL de tampón de lisis, mortero de lavado B. Transfiera el homogeneizado (1,9 ml) a un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    4. Centrifugar a 200 x g durante 1,5 min a 4 °C para eliminar el tejido y los vasos sanguíneos no disociados14. El sobrenadante contiene los núcleos; Deseche la bolita de tejido no disociado.
    5. Después de humedecer previamente un filtro celular de 30 μm con 100 μL de tampón de lisis, y filtrar el sobrenadante a través del filtro celular en un tubo cónico de 15 ml. Luego, transfiera la mezcla que contiene núcleos a un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    6. Centrifugar la muestra a 500 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante. El pellet contiene núcleos.
    7. Resuspender el pellet nuclear en 250 μL de tampón de lisis helada haciendo vórtices brevemente a velocidad moderada a alta. Lleve el volumen hasta 1,75 ml añadiendo 1,5 ml de tampón de lisis. Mezclar suavemente y descansar la suspensión nuclear sobre hielo durante 5 min.
    8. Granular los núcleos por centrifugación a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche cuidadosamente el sobrenadante sin alterar el pellet nuclear. Resuspender el pellet en 200 μL de tampón de almacenamiento helado y vorátice brevemente para resuspender completamente el pellet nuclear.
    9. Reservar el 10% del pellet resuspendido (20 μL) como muestra de núcleos de entrada para análisis posteriores.
    10. Tome el pellet de núcleos resuspendidos y enrase el volumen a 2.0 ml con NPB helado. Proceda a aislar los núcleos marcados utilizando el método de purificación basado en afinidad INTACT.
  3. Aislamiento de núcleos marcados en tipos celulares específicos (INTACTOS)
    1. Vierta las perlas de estreptavidina en el vial durante 30 s a velocidad media para asegurarse de que estén completamente resuspendidas. Agregue 30 μL de perlas resuspendidas para cada muestra en un tubo de fondo redondo de 2 ml (las perlas para hasta 10 muestras se pueden lavar en un solo tubo), agregue 1 ml de NPB y resuspenda bien con pipeteo.
    2. Coloque el tubo en la rejilla magnética durante 1 minuto para separar las perlas. Deseche el sobrenadante y retire el tubo del imán. Resuspender las perlas magnéticas lavadas en 1 ml de NPB.
    3. Repita el paso de lavado para un total de tres lavados. Después del lavado final, resuspender las perlas en el volumen inicial de NPB (30 μL por muestra).
    4. Añadir 30 μL de perlas lavadas a la suspensión nuclear de 2 ml a partir de la etapa 2.2.10. Resuspenda bien la mezcla de perla-núcleo pipeteando e invirtiendo suavemente el tubo.
    5. Coloque los tubos en un mezclador giratorio en una cámara frigorífica o refrigerador durante 30 minutos a baja velocidad. Incubar las muestras de entrada sin cuentas en las mismas condiciones.
    6. Coloque los tubos con la suspensión nuclear y las perlas en el imán, y separe los núcleos biotinilados unidos a las perlas de estreptavidina (fracción positiva) de la fracción negativa de los núcleos. Deje que las perlas se separen en el imán durante 3 minutos.
    7. Retire el sobrenadante, pase la fracción negativa a un tubo fresco de 2.0 ml y reserve en hielo. Para cada tubo de fracción positiva, retire el tubo del imán y vuelva a suspender el contenido en 1 ml de NPB.
    8. Coloque el tubo en el imán durante 1 minuto y deseche el sobrenadante. Retire el tubo del imán y vuelva a suspender la mezcla de perla y núcleos lavada en 1 ml de NPB.
    9. Repita el paso 2.3.8 para un total de tres lavados. Después de completar tres lavados, resuspender la mezcla de fracción positiva de perla-núcleo en 30 μL de NPB.
    10. Para cada tubo de fracción negativa, centrifugar la suspensión nuclear a partir del paso 2.3.7 a 500 x g durante 7 min a 4 °C. Aspire y deseche cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender la fracción negativa del pellet de núcleos en 30 μL de NPB.
    11. Almacene los núcleos de la entrada (paso 2.2.9), la fracción negativa (paso 2.3.10) y la fracción positiva (paso 2.3.9) en un congelador de −80 °C hasta que estén listos para el aislamiento nuclear de ADN o ARN.
      NOTA: Los núcleos no deben congelarse para protocolos que requieran núcleos intactos como entrada (es decir, ensayo para cromatina accesible a transposasa, inmunoprecipitación de cromatina).

3. Aislamiento de ARNm de tipos específicos de células ováricas

  1. Preparación de los búferes
    1. Base tampón TRAP: Prepare 100 mL de base tampón TRAP combinando 78.8 mL de agua libre de RNasa, 5 mL de 1 M Tris-HCl (concentración final: 50 mM Tris [pH 7.5]), 5 mL de 2 M KCl (100 mM KCl), 1.2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) y 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    2. Base tampón con alto contenido de sal: Prepare 100 ml de base tampón con alto contenido de sal combinando 68,8 ml de agua libre de RNasa, 5 ml de 1 M de Tris-HCl (concentración final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 ml de 2 M KCl (300 mM KCl), 1,2 ml de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) y 10 ml de 10% de NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
    3. Tampón de homogeneización TRAP (completo): Prepare 1,5 ml por muestra el día de la recolección de tejido. Preparar 10 ml de tampón de homogeneización de TRAP combinando 10 ml de base tampón TRAP (a partir del paso 3.1.1) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml (concentración final: 100 μg/ml de cicloheximida), 10 mg de heparina sódica (1 mg/ml de heparina sódica), 20 μL de DTT 0,5 M (DTT de 1 mM), 50 μL de inhibidor de la RNasa de 40 U/μL (inhibidor de la RNasa de 200 U/ml), 200 μL de espermidina 0,1 M (espermidina 2 mM) y un comprimido inhibidor de la proteasa libre de EDTA (1x).
    4. Tampón de lavado bajo en sal (completo): Haga 1.5 ml por muestra el día de la recolección de tejido. Para producir 10 ml de tampón de lavado con bajo contenido de sal, combine 10 ml de base tampón TRAP (del paso 3.1.1) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml (cicloheximida de 100 μg/ml) y 20 μL de DTT 0,5 M (DTT de 1 mM).
    5. Tampón de lavado con alto contenido de sal (completo): Haga 1.5 ml por muestra en el segundo día de aislamiento de TRAP. Para producir 10 ml de tampón de lavado con alto contenido de sal, combine 10 ml de base tampón con alto contenido de sal (del paso 3.1.2) con 10 μL de cicloheximida de 100 mg/ml y 20 μL de DTT de 0,5 M.
  2. Realización de la purificación de afinidad ribosómica (TRAP) de traducción
    1. Recoger el otro ovario de un ratón Cyp17-NuTRAP (u otro Cre-NuTRAP relevante) y colocarlo en un tubo libre de RNasa de 1,5 ml que contenga 100 μL de tampón de homogeneización TRAP helado (del paso 3.1.3). Picar el ovario en ocho partes dentro del tampón con microtijeras de apertura automática.
    2. Use puntas de diámetro ancho para transferir el ovario y 100 μL de tampón de homogeneización a un homogeneizador de vidrio Dounce. Homogeneizar 10x-20x con el mortero suelto A. Añadir 400 μL de tampón de homogeneización TRAP, mortero de lavado A.
    3. Transfiera el homogeneizado a un tubo de fondo redondo de 2 ml. Lave el homogeneizador Dounce con 1 ml adicional de tampón de homogeneización TRAP y transfiera el volumen lavado al tubo de fondo redondo de 2 ml.
    4. Centrifugar el homogeneizado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante aclarado a un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml. Deseche el pellet.
    5. Transfiera 100 μL del homogeneizado aclarado a un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml y reserve como entrada en hielo.
    6. Incubar el resto del homogeneizado aclarado (a partir de la etapa 3.2.4) con un anticuerpo anti-GFP (5 μg/ml) durante 1 h a 4 °C mientras gira de extremo a extremo. Incubar la muestra de entrada en las mismas condiciones.
    7. En los últimos 15 minutos de la incubación, lavar las perlas magnéticas de proteína G en el tampón de lavado con bajo contenido de sal siguiendo los siguientes pasos (3.2.8-3.2.11).
    8. Vortex el vial de perlas magnéticas de proteína G durante 30 s para resuspender completamente. Transfiera 50 μL de las perlas magnéticas de proteína G para cada muestra (se pueden lavar hasta 10 muestras en un tubo) en un tubo de fondo redondo de 2 ml.
    9. Agregue 500 μL de tampón de lavado bajo en sal a las perlas y pipete suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 1 minuto para recoger las perlas contra el costado del tubo. Retire y deseche el sobrenadante.
    10. Retire el tubo del soporte magnético y agregue 1 ml de tampón de lavado con bajo contenido de sal al tubo. Pipetear suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético durante 1 minuto para recoger las perlas contra el costado del tubo. Retire y deseche el sobrenadante.
    11. Repita el paso 3.2.10 para un total de tres lavados. Después del lavado final, retire el tubo de la rejilla magnética y vuelva a suspender las perlas en el volumen inicial de tampón de lavado con baja sal (50 μL por muestra).
    12. Transfiera las perlas lavadas resuspendidas (50 μL) a la mezcla de muestra de antígeno/anticuerpo, e incube a 4 °C durante la noche mientras gira en un mezclador de extremo a extremo. Incubar las muestras de entrada girando de extremo a extremo a 4 °C durante la noche para mantener condiciones equivalentes.
    13. Después de la incubación nocturna, retire los tubos del rotador y separe las perlas magnéticas con los ribosomas/ARN objetivo (fracción positiva) del sobrenadante (fracción negativa) utilizando el soporte magnético durante 2,5-3 min. Aspire la fracción negativa, colóquela en un tubo fresco de fondo redondo de 2 ml y déjela a un lado en hielo mientras procesa la fracción positiva.
    14. Añadir 500 μL de tampón de lavado con alto contenido de sal (desde el paso 3.1.5) al tubo con la fracción positiva, y pipetear suavemente para mezclar. Coloque el tubo en un soporte magnético mantenido sobre hielo durante 1 minuto para separar las cuentas. Deseche el sobrenadante y retire el tubo del imán.
    15. Repita el paso 3.2.14 para un total de tres lavados. Después del lavado final, resuspender las perlas en 350 μL de tampón de lisis de ARN suplementado con 3,5 μL de 2-mercaptoetanol (BME). Incubar los tubos a temperatura ambiente mientras se mezclan durante 10 minutos a 900 rpm en un agitador digital.
    16. Separe las perlas de la solución que ahora contiene los ribosomas/ARN diana con un soporte magnético durante 1 minuto a temperatura ambiente. Recoja la fracción positiva eluyida (sobrenadante) en un tubo fresco de 1,5 ml y agregue 350 μL de etanol al 100%. Invertir para mezclar. Proceda al aislamiento de ARN.
    17. Opcional: Para aislar el ARN de la muestra de entrada (paso 3.2.5) y la fracción negativa (paso 3.2.13), transfiera 100 μL de las fracciones de entrada y negativa a tubos frescos de 1,5 ml. Añadir 350 μL de tampón de lisis de ARN suplementado con 3,5 μL de BME a cada muestra. Invertir para mezclar. Agregue 250 μL de etanol al 100% a cada tubo e invierta para mezclar. Proceda al aislamiento de ARN.
  3. Aislamiento de ARN
    1. Transfiera 700 μL de la fracción positiva y, opcionalmente, la fracción de entrada y/o negativa a una columna de espín de ARN. Siga las instrucciones del fabricante para aislar el ARN de la columna de centrifugado.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En la figura 1 se muestra un esquema de los protocolos TRAP e INTACT. Aquí la especificidad del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP para las células del estroma ovárico/teca se demuestra mediante imágenes inmunofluorescentes y RNA-Seq a partir de ARN aislado en TRAP. Primero, se realizaron imágenes de inmunofluorescencia de la señal de eGFP en el ovario y la localización de la señal de eGFP a las células tecales y estromales. Brevemente, las secciones de 5 μm fueron desparafinadas con un gradiente de xileno y etanol. Para una mejor señalización de eGFP, la proteína eGFP se tiñó utilizando el anticuerpo primario anti-GFP de cabra y el anticuerpo secundario anti-cabra Alexa 488 burro, y los núcleos se tiñeron con DAPI15. Las imágenes se tomaron en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 20x (Figura 2A). A continuación, TRAP se realizó en ovarios de ratones Cyp17-NuTRAP de 4 meses de edad para aislar el ARN unido a ribosomas específicamente de las células teca / estromales. El ARN aislado de TRAP (fracción positiva) y el ARN de tejido completo (entrada) se utilizaron para construir bibliotecas de secuenciación de ARN trenzado para secuenciar en un secuenciador de próxima generación. Se realizó el recorte, alineación y normalización de RNA-Seq (DESeq2), como se describió anteriormente 7,8. El análisis de componentes principales (ACP) mostró una fuerte separación de la fracción de entrada y positiva en el primer componente, sugiriendo perfiles transcriptómicos distintos (Figura 2B). Hubo 2.009 genes expresados diferencialmente entre las fracciones de entrada y positivas, como se ve en la gráfica del volcán (prueba t pareada, corrección de prueba múltiple de Benjamini-Hochberg FDR < 0.05, cambio de pliegue >2; Figura 2C). De los genes expresados diferencialmente, se pudo observar el enriquecimiento de los marcadores de células estromales y teca (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) y el agotamiento de los genes16 de ovocitos (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), células inmunes (C1qa, C1qb, Fcerg1) y células musculares lisas (Mfap5) (Figura 2D).

Figure 1
Figura 1: Aislamiento de núcleos específicos de tipo celular y ARNm del modelo Cyp17-NuTRAP utilizando los métodos INTACT y TRAP. (A) La generación de la línea Cyp17-NuTRAP se logra cruzando un NuTRAP flox/flox hembra con un macho Cyp17iCre+/+ . (B) Esquema de las metodologías TRAP e INTACT para aislar núcleos y polisomas de las células estromales/teca del ratón Cyp17-NuTRAP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Validación del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP. (A) Se realizó inmunofluorescencia en los ovarios parafinados de ratones Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT y Cyp17-Cre−/−NuTRAP flox/WT. La proteína eGFP se tiñó con el anticuerpo primario anti-GFP de cabra y el anticuerpo secundario anti-cabra Alexa 488 burro, y los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes se tomaron en un microscopio de fluorescencia con un aumento de 20x. (B-D) El ARN de entrada y fracción positiva TRAP se aisló de los ovarios de ratón Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT (n = 4), utilizados para preparar bibliotecas de RNA-Seq trenzadas, como se hizo anteriormente7, y se secuenciaron de manera pareada. Se realizó el recorte, alineación y normalización de RNA-Seq (DESeq2), como se hizo anteriormente 7,8. (B) El análisis de componentes principales (PCA) de todos los genes expresados mostró una separación de la entrada de TRAP y fracciones positivas en el primer componente (51,4% de varianza explicada). (C) Diagrama volcánica de genes expresados diferencialmente entre las fracciones de entrada y positivas (prueba t pareada, corrección de prueba múltiple de Benjamini-Hochberg FDR < 0.05, cambio de pliegue >2). (D) La comparación de la fracción positiva de TRAP con la entrada (log2[cambio de pliegue] ([fracción ositiva/entrada)]) mostró un enriquecimiento general de los genes marcadores de células estromales/teca y el agotamiento de los genes marcadores de ovocitos, granulosa, inmunes y células musculares lisas (SMC) en la fracción positiva de TRAP (prueba t pareada, corrección de prueba múltiple de Benjamini-Hochberg FDR < 0.10, n = 4). Las barras representan la media log2[cambio de pliegue (fracción positiva/entrada)] ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El modelo de ratón NuTRAP 6 es un poderoso enfoque de etiquetado transgénico para la interrogación pareada del transcriptoma y el epigenoma de tipos de células específicas que se pueden adaptar a cualquier tipode célula con un controlador Cre disponible. Aquí, demostramos la especificidad del modelo de ratón Cyp17-NuTRAP para dirigirse a la teca ovárica y las células del estroma. El modelo Cyp17-NuTRAP se puede utilizar para dilucidar aún más los mecanismos epigenéticos específicos de las tecas y las células estromales involucradas en el envejecimiento ovárico, el cáncer y la enfermedad.

Al seleccionar un controlador Cre, se recomienda validar la especificidad celular de la expresión NuTRAP mediada por Cre utilizando varios enfoques ortogonales. El Cyp17a1-Cre se expresa constitutivamente. El modelo NuTRAP también se puede cruzar con líneas Cre inducibles para evitar la expresión transitoria de genes en células no diana durante el desarrollo. Dado que la mayoría de las células ováricas son altamente sensibles a las fluctuaciones hormonales, la estadificación del ciclo estral también debe considerarse17.

El enfoque NuTRAP tiene muchos beneficios en comparación con las técnicas tradicionales de clasificación celular. En primer lugar, las técnicas de clasificación celular se basan en la creación de suspensiones unicelulares, que pueden causar la inducción de artefactos de activación ex vivo 8. Además, la clasificación celular se basa en marcadores de superficie celular, que pueden cambiar con la edad o los estados de enfermedad, lo que pone en duda si las poblaciones de células que se comparan entre dos grupos experimentales son realmente equivalentes. El etiquetado de marcadores de superficie celular también se basa en la identificación de anticuerpos fiables para la inmunotinción18.

Durante la última década, ha habido una expansión en las técnicas transcriptómicas de células individuales / núcleos 19,20,21,22,23 y epigenómicas24,25,26 para explorar la heterogeneidad de las poblaciones celulares. Si bien estos enfoques han llevado a una mayor apreciación de la heterogeneidad celular, a menudo sufren de una falta de sensibilidad y cobertura genómica, lo que puede limitar la profundidad de los análisis. Por ejemplo, las técnicas transcriptómicas de una sola célula (scRNA) solo detectan ~ 1,000-5,000 genes por célula27, mientras que la técnica NuTRAP utilizada en este estudio detectó 14,980 genes. Además, varias técnicas de scRNA se basan en el marcado 3' o 5' 20,21,22,28,29,30, lo que no permite el análisis de isoformas específicas de ARN disponibles utilizando la metodología TRAP-seq.

Mientras que la transcriptómica unicelular se ha convertido en un lugar común en la biología molecular (revisada en Aldridge y Teichmann31), el campo epigenético se ha quedado atrás. La mayoría de las técnicas epigenómicas unicelulares se basan en la deposición de células o técnicas microfluídicas seguidas de la preparación de bibliotecas a partir de células individuales. Como tal, el rendimiento para las técnicas epigenómicas de una sola célula es generalmente menor que para los métodos de encapsulación de gotas comúnmente utilizados para RNA-Seq32 de una sola célula. La reciente adición de un ensayo de una sola célula (sc) o de un solo núcleo (sn) para la cromatina transponible accesible (ATAC-Seq) a la familia genómica 10x de soluciones de células individuales representa el primer método basado en gotas que permite la interrogación de un punto final epigenómico (accesibilidad a la cromatina) a una resolución de una sola célula. Las técnicas de multiplexación, como CoBATCH-Seq24 para modificaciones de histonas, han aumentado drásticamente el rendimiento, pero no al nivel de los enfoques basados en gotas. La secuenciación de metilo de núcleos únicos (snmC-Seq) se ha realizado utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia en pocillos individuales y la preparación de la biblioteca BS-Seq25,26. Sin embargo, la conversión severa de bisulfato conduce a una cobertura dispersa de todo el genoma, lo que requiere un gran binning genómico durante el análisis de datos (~ 100 kb) y hace que se pierda el contexto genómico necesario para sacar conclusiones científicas sólidas. El modelo de ratón NuTRAP permite el análisis sensible del epigenoma y el transcriptoma de tipos celulares específicos.

Con respecto al procedimiento TRAP, hay algunas consideraciones para garantizar un aislamiento exitoso. Primero, el ovario debe cortarse antes de la homogeneización para romper la membrana externa y permitir la disociación completa. El ovario es un tejido fibroso, especialmente en ratones más viejos, lo que dificulta la homogeneización completa. Sin embargo, durante la optimización de este protocolo, la homogeneización agresiva durante el protocolo TRAP resultó en la contaminación de los aislados de ARN, con bandas visibles de ADN mostradas por electroforesis capilar. Para resolver este problema, se incluyeron 2 mM de espermidina en el tampón de homogeneización TRAP para estabilizar la membrana nuclear33. Además, solo homogeneizamos las muestras de TRAP con el mortero suelto A para evitar la interrupción de la membrana nuclear. Es importante verificar las muestras de ARN en un Bioanalizador o TapeStation después del aislamiento para garantizar un número de integridad de ARN >7 antes de proceder a las aplicaciones de secuenciación.

Para el procedimiento INTACTO, el ovario también debe cortarse antes de la homogeneización. Además, hemos encontrado que un giro corto y de baja velocidad (200 x g durante 1,5 min) después de la homogeneización es eficaz para eliminar tejido y vasos sanguíneos no disociados, como se hizo anteriormente 7,14. Si el ARN nuclear es un criterio de valoración deseado, se debe incluir un inhibidor de la RNasa en los tampones INTACTOS. El ARN-Seq nuclear o RT-qPCR se puede utilizar para probar la especificidad celular de los aislamientos INTACTOS. Las perlas de estreptavidina tienen una afinidad increíblemente alta por la biotina, lo que dificulta la separación de las perlas de los núcleos de biotina + siguiendo el protocolo INTACTO, y esto debe considerarse al planificar aplicaciones posteriores. Además de aislar núcleos específicos de tipo celular de los modelos NuTRAP utilizando INTACT, los núcleos también se pueden clasificar en función de la expresión de eGFP para aplicaciones posteriores. El procedimiento INTACT para aislar núcleos se puede utilizar para evaluar varios criterios de valoración, incluida la transcriptómica nuclear, la epigenómica y la proteómica.

Las técnicas antes mencionadas son excelentes herramientas para las evaluaciones del envejecimiento ovárico. El envejecimiento ovárico es una preocupación no solo desde una perspectiva reproductiva sino también desde una perspectiva de salud. La menopausia, que es el cese de la función ovárica, se asocia con la aceleración de los relojes biológicos34, y la menopausia precoz se asocia con una vida más corta y un mayor riesgo de enfermedades en las mujeres35,36. Se sabe que el envejecimiento de los ovocitos está directamente relacionado con una disminución de la aptitud ovárica. Sin embargo, también se cree que otros tipos de células desempeñan un papel en la disminución de la salud ovárica y un aumento de la senescencia e inflamación ovárica37. Una mejor comprensión de qué células están involucradas en este proceso y cómo ralentizarlo es clave. A pesar de que existen diferencias innegables entre la dinámica ovárica humana y murina, los modelos de ratón siguen siendo herramientas importantes para investigar la biología ovárica. En este contexto, los modelos Cre-NuTRAP pueden ser herramientas útiles para identificar los objetivos de tipo celular más efectivos para los intentos de retrasar el envejecimiento ovárico y la menopausia.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) y Presbyterian Health Foundation. Este trabajo también fue apoyado en parte por el premio MERIT I01BX003906 y un premio del Programa de Evaluación de Equipos Compartidos (ShEEP) ISIBX004797 de los Estados Unidos (EE. Departamento de Asuntos de Veteranos, Servicio de Investigación y Desarrollo de Laboratorios Biomédicos. Los autores también desean agradecer al Centro de Genómica Clínica (OMRF) y al Imaging Core Facility (OMRF) por la asistencia y el uso del instrumento.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 M Spermidine Sigma-Aldrich 05292-1ML-F
1 M MgCl2 Thermo Scientific AM9530G
10% NP-40 Thermo Scientific 85124
100 mg/mL Cycloheximide Sigma-Aldrich C4859-1ML
2-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
30 µm cell strainer  Miltenyi Biotec 130-098-458
All Prep DNA/RNA Mini Kit Qiagen 80204
anti-GFP antibody Abcam Ab290 For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP)
Buffer RLT Qiagen 79216 RNA Lysis Buffer in protocol
cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet Roche 11836170001 For TRAP Homogenization Buffer
Cyp17iCre mouse model The Jackson Laboratory 28547 B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J
DynaMag-2 magnet Invitrogen 12321D
Genotyping Primers IDT Custom Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339
         Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663
         NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626
Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) Thermo Scientific 1861278 For NPB Buffer
M-280 Streptavidin Dynabeads  Invitrogen 11205D 2.8 µm bead diameter
MixMate Eppendorf 5353000529
Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep Sigma-Aldrich Nuc101 Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer
1 M HEPES Gibco 15630-080
5 M NaCl Thermo Scientific AM9760G
2M KCl Thermo Scientific AM9640G
0.5 M EDTA Thermo Scientific AM9260G
0.5 M EGTA Fisher Scientific 50-255-956
NuTRAP mouse model The Jackson Laboratory 29899 B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J
Pierce DTT No-Weigh Format Thermo Scientific A39255
Protein G Dynabeads ThermoFisher 10004D For TRAP
RNaseOUT Invitrogen 10777019
Sodium Heparin Fisher Scientific BP2425
Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 Invitrogen 15567-027
VWR Tube Rotator Fisher Scientific NC9854190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
  2. Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
  3. Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
  4. Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
  5. Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
  6. Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
  7. Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
  8. Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
  9. Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
  10. Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
  11. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
  12. Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
  13. Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
  14. Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
  15. Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
  16. Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
  17. Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
  18. Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
  19. Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
  20. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
  21. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  22. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  23. Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell 'omics' with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
  24. Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
  25. Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
  26. Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
  27. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
  28. Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
  29. Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
  30. Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
  31. Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
  32. Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
  33. Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
  34. Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
  35. Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
  36. Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
  37. Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).

Tags

Este mes en JoVE Número 192
Interrogación pareada específica de células del epigenoma ovárico y transcriptoma de ratón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ocañas, S. R., Isola, J. V. V., … More

Ocañas, S. R., Isola, J. V. V., Saccon, T. D., Pham, K. D., Chucair-Elliott, A. J., Schneider, A., Freeman, W. M., Stout, M. B. Cell-Specific Paired Interrogation of the Mouse Ovarian Epigenome and Transcriptome. J. Vis. Exp. (192), e64765, doi:10.3791/64765 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter