Zellspezifische paarweise Abfrage des Ovarialepigenoms und des Transkriptoms der Maus
Summary
In diesem Protokoll wurden die translatierende Ribosomenaffinitätsreinigungsmethode (TRAP) und die Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert wurden (INTACT), für die paarweise Abfrage des zellspezifischen ovariellen Transkriptoms und Epigenoms unter Verwendung des NuTRAP-Mausmodells, das mit einer Cyp17a1-Cre-Mauslinie gekreuzt wurde, optimiert.
Abstract
Die Beurteilung zelltypspezifischer epigenomischer und transkriptomischer Veränderungen ist der Schlüssel zum Verständnis der Ovarialalterung. Zu diesem Zweck wurde die Optimierung der translatierenden Ribosomenaffinitätsreinigungsmethode (TRAP) und die Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (INTACT), für die anschließende paarweise Abfrage des zellspezifischen ovariellen Transkriptoms und Epigenoms unter Verwendung eines neuartigen transgenen NuTRAP-Mausmodells durchgeführt. Die Expression des NuTRAP-Allels wird von einer gefloxten STOP-Kassette kontrolliert und kann mit Hilfe von Promotor-spezifischen Cre-Linien auf bestimmte ovarielle Zelltypen ausgerichtet werden. Da neuere Studien darauf hindeuten, dass ovarielle Stromazellen für die Entstehung vorzeitiger Alterungsphänotypen verantwortlich sind, wurde das NuTRAP-Expressionssystem mit einem Cyp17a1-Cre-Treiber auf Stromazellen ausgerichtet. Die Induktion des NuTRAP-Konstrukts war spezifisch für ovarielle stromale Fibroblasten, und es wurden ausreichend DNA und RNA für Sequenzierungsstudien aus einem einzigen Eierstock gewonnen. Das hier vorgestellte NuTRAP-Modell und die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um jeden ovariellen Zelltyp mit einer verfügbaren Cre-Linie zu untersuchen.
Introduction
Die Eierstöcke spielen eine wichtige Rolle beim somatischen Altern1, wobei bestimmte Zellpopulationen unterschiedliche Beiträge leisten. Die zelluläre Heterogenität des Eierstocks macht es schwierig, molekulare Ergebnisse aus Bulk-Tests für den gesamten Eierstock zu interpretieren. Das Verständnis der Rolle bestimmter Zellpopulationen bei der Alterung der Eierstöcke ist der Schlüssel zur Identifizierung der molekularen Treiber, die für die Fruchtbarkeit und den Gesundheitsverlust bei älteren Frauen verantwortlich sind. Traditionell wurde die Multi-Omics-Bewertung spezifischer Ovarialzelltypen durch Techniken wie Lasermikrodissektion2, Einzelzellansätze3 oder Zellsortierung4 erreicht. Die Mikrodissektion kann jedoch teuer und schwierig durchzuführen sein, und die Zellsortierung kann zelluläre phänotypische Profile verändern5.
Ein neuartiger Ansatz zur Bewertung von ovariellen Zelltyp-spezifischen epigenomischen und transkriptomischen Profilen verwendet das NuTRAP-Mausmodell (NuTRAP) zur Markierung und Translation der Ribosomenaffinitätsreinigung. Das NuTRAP-Modell ermöglicht die Isolierung von zelltypspezifischen Nukleinsäuren, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist, indem die Methoden der Affinitätsreinigung verwendet werden: Ribosomen-Affinitätsreinigung (TRAP) und Isolierung von Zellkernen, die in bestimmten Zelltypen markiert sind (INTACT)6. Die Expression des NuTRAP-Allels wird von einer gefloxten STOP-Kassette kontrolliert und kann mit Hilfe von Promotor-spezifischen Cre-Linien auf bestimmte ovarielle Zelltypen ausgerichtet werden. Durch die Kreuzung der NuTRAP-Maus mit einer zelltypspezifischen Cre-Linie bewirkt die Entfernung der STOP-Kassette eine eGFP-Markierung des ribosomalen Komplexes und eine Biotin/mCherry-Markierung des Zellkerns in Cre-abhängiger Weise6. Die TRAP- und INTACT-Techniken können dann verwendet werden, um mRNA und Kern-DNA aus dem interessierenden Zelltyp zu isolieren und zu transkriptomischen und epigenomischen Analysen überzugehen.
Das NuTRAP-Modell wurde in verschiedenen Geweben wie Fettgewebe6, Hirngewebe 7,8,9 und der Netzhaut10 verwendet, um zelltypspezifische epigenomische und transkriptomische Veränderungen aufzudecken, die in Ganzgewebehomogenaten möglicherweise nicht nachgewiesen werden können. Zu den Vorteilen des NuTRAP-Ansatzes gegenüber herkömmlichen Zellsortiertechniken gehören die folgenden: 1) die Vermeidung von Ex-vivo-Aktivierungsartefakten 8, 2) der minimierte Bedarf an spezialisierten Geräten (z. B. Zellsortierern) und 3) der erhöhte Durchsatz und die geringeren Kosten für zelltypspezifische Analysen. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, zelltypspezifische DNA und RNA aus einer einzigen Maus zu isolieren, paarweise Analysen, die die statistische Aussagekraft erhöhen. Da neuere Studien gezeigt haben, dass ovarielle Stromazellen für die vorzeitige Alterung der Phänotypen11,12,13 verantwortlich sind, haben wir das NuTRAP-Expressionssystem mit einem Cyp17a1-Cre-Treiber auf Stroma- und Thekazellen ausgerichtet. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Induktion des NuTRAP-Konstrukts spezifisch für ovarielle Stroma- und Thekazellen ist und dass genügend DNA und RNA für Sequenzierungsstudien aus einem einzigen Eierstock gewonnen werden. Das NuTRAP-Modell und die hier vorgestellten Methoden können verwendet werden, um jeden ovariellen Zelltyp mit jeder verfügbaren Cre-Linie zu untersuchen.
Für die Generierung einer zelltypspezifischen ovariellen NuTRAP-Mauslinie verfügt das NuTRAP-Allel über ein floxiertes STOP-Codon, das die Expression von BirA, Biotin-Ligase-Erkennungspeptid (BLRP)-markiertem mCherry/mRANGAP1 und eGFP/L10a kontrolliert. Bei Kreuzung mit einer zelltypspezifischen Cre-Linie markiert die Expression der NuTRAP-Kassette das nukleäre Protein mRANGAP1 mit Biotin/mCherry und das ribosomale Protein L10a mit eGFP in Cre-abhängiger Weise. Dies ermöglicht die Isolierung von Zellkernen und mRNA aus bestimmten Zelltypen, ohne dass eine Zellsortierung erforderlich ist. Um dies zu beurteilen, kann derNuTRAP flox/flox mit einem zelltypspezifischen Cre gepaart werden, das für ovarielle Zelltypen relevant ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das NuTRAP-Mausmodell6 ist ein leistungsfähiger transgener Markierungsansatz für die paarweise Abfrage des Transkriptoms und des Epigenoms von spezifischen Zelltypen, die mit einem verfügbaren Cre-Treiber an jeden Zelltyp angepasst werden können. In dieser Arbeit demonstrieren wir die Spezifität des Cyp17-NuTRAP-Mausmodells bei der Ausrichtung auf Ovarial-, Theka- und Stromazellen. Das Cyp17-NuTRAP-Modell kann verwendet werden, um die theka- und stromazellspezifischen epigenetischen Mechanism…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), der BrightFocus Foundation (M2020207) und der Presbyterian Health Foundation unterstützt. Diese Arbeit wurde auch teilweise durch den MERIT-Preis I01BX003906 und einen Shared-Equipment-Evaluierungsprogramm-Preis (ShEEP) ISIBX004797 aus den Vereinigten Staaten (USA) unterstützt. Abteilung für Veteranenangelegenheiten, Forschungs- und Entwicklungsdienst für biomedizinische Laboratorien. Die Autoren bedanken sich auch beim Clinical Genomics Center (OMRF) und der Imaging Core Facility (OMRF) für die Unterstützung und die Nutzung der Instrumente.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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