Summary
Neste protocolo, o método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram otimizados para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando o modelo de camundongo NuTRAP cruzado com uma linhagem de camundongo Cyp17a1-Cre.
Abstract
A avaliação das alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular é fundamental para a compreensão do envelhecimento ovariano. Para este fim, a otimização do método de purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e o isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT) foram realizados para a subsequente interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma ovariano célula-específica usando um novo modelo transgênico de camundongo NuTRAP. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Uma vez que estudos recentes implicaram células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce, o sistema de expressão NuTRAP foi direcionado para células estromais usando um driver Cyp17a1-Cre. A indução da construção NuTRAP foi específica para fibroblastos estromais ovarianos, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento foram obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com uma linha Cre disponível.
Introduction
Os ovários são os principais atores no envelhecimento somático1, com contribuições distintas de populações celulares específicas. A heterogeneidade celular do ovário dificulta a interpretação dos resultados moleculares de ensaios volumosos de ovário inteiro. Compreender o papel de populações celulares específicas no envelhecimento ovariano é fundamental para identificar os fatores moleculares responsáveis pelo declínio da fertilidade e da saúde em mulheres idosas. Tradicionalmente, a avaliação multi-ômica de tipos específicos de células ovarianas era realizada por técnicas como microdissecção a laser2, abordagens unicelulares3 ou triagem celular4. No entanto, a microdissecção pode ser cara e de difícil execução, e a triagem celular pode alterar o perfil fenotípicocelular5.
Uma nova abordagem para avaliar perfis epigenômicos e transcriptômicos específicos de células ovarianas usa o modelo de camundongo de purificação de afinidade de ribossomo nuclear (NuTRAP). O modelo NuTRAP permite o isolamento de ácidos nucléicos específicos do tipo celular sem a necessidade de triagem celular usando os métodos de purificação por afinidade: tradução da purificação por afinidade do ribossomo (TRAP) e isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACT)6. A expressão do alelo NuTRAP está sob o controle de um STOP floxado e pode ser direcionada para tipos específicos de células ovarianas usando linhas Cre promotoras-específicas. Ao cruzar o camundongo NuTRAP com uma linha Cre específica do tipo celular, a remoção do STOP causa marcação eGFP do complexo ribossomal e marcação biotina/mCherry do núcleo de maneira dependentede Cre 6. As técnicas TRAP e INTACT podem então ser usadas para isolar o RNAm e o DNA nuclear do tipo celular de interesse e proceder a análises transcriptômicas e epigenômicas.
O modelo NuTRAP tem sido utilizado em diferentes tecidos, como tecido adiposo6, tecido cerebral 7,8,9 e retina10, para revelar alterações epigenômicas e transcriptômicas específicas do tipo celular que podem não ser detectadas no homogeneizado de tecido total. Os benefícios da abordagem NuTRAP sobre as técnicas tradicionais de classificação celular incluem o seguinte: 1) a prevenção de artefatos de ativação ex vivo 8, 2) a necessidade minimizada de equipamentos especializados (i.e., classificadores celulares) e 3) o aumento do rendimento e a diminuição do custo das análises específicas do tipo celular. Além disso, a capacidade de isolar DNA e RNA específicos do tipo celular de um único camundongo permite análises pareadas que aumentam o poder estatístico. Uma vez que estudos recentes têm implicado células estromais ovarianas na condução de fenótipos de envelhecimento precoce 11,12,13, direcionamos o sistema de expressão NuTRAP para células estromais e tecais usando um driver Cyp17a1-Cre. Aqui, demonstramos que a indução da construção NuTRAP é específica para células do estroma ovariano e teca, e DNA e RNA suficientes para estudos de sequenciamento são obtidos de um único ovário. O modelo e os métodos NuTRAP aqui apresentados podem ser usados para estudar qualquer tipo de célula ovariana com qualquer linha Cre disponível.
Para a geração de uma linhagem de camundongos NuTRAP ovarianos específicos do tipo celular, o alelo nuclear de marcação e purificação de afinidade do ribossomo (NuTRAP) tem um códon STOP floxado que controla a expressão de BirA, peptídeo de reconhecimento de biotina ligase (BLRP) marcado com mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando cruzada com uma linha Cre específica do tipo celular, a expressão do NuTRAP rotula a proteína nuclear mRANGAP1 com biotina/mCherry e a proteína ribossomal L10a com eGFP de maneira Cre-dependente. Isso permite o isolamento de núcleos e RNAm de tipos celulares específicos sem a necessidade de classificação celular. Oflox/flox NuTRAP pode ser emparelhado com um Cre específico para o tipo de célula relevante para os tipos de células ovarianas para avaliar isso.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF). Camundongos progenitores foram adquiridos no Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e criados e alojados sob condições de FPS em um ambiente de barreira HEPA em um ciclo claro/escuro de 14 h/10 h (luzes acesas às 6:00 horas) na OMRF.
NOTA: Nesta demonstração, usamos um macho Cyp17iCre+/−(Strain # 028547, The Jackson Laboratory) emparelhado com uma fêmea NuTRAP (Strain # 029899, The Jackson Laboratory). A progênie desejada Cyp17-NuTRAP (Cyp17iCre+/−; NuTRAPflox/WT) expressará o alelo NuTRAP sob o controle do promotor Cyp17a1 em células do estroma ovariano. Para a preparação deste manuscrito, foram utilizados camundongos fêmeas Cyp17-NuTRAP com 4 meses de idade (n = 4). DNA foi extraído de amostras de punch de orelha de camundongo para genotipagem para confirmação da herança dos transgenes Cyp17iCre e NuTRAP e para a detecção por PCR de 1) Cre genérico, 2) Cyp17iCre, e 3) floxed NuTRAP usando os primers listados na Tabela de Materiais, conforme descrito anteriormente 7,8.
1. Dissecção ovariana de camundongo
- Realizar a eutanásia de camundongos de acordo com as orientações de cuidados com os animais e aprovação da instituição, seguida da coleta de ovários.
- Disseque os ovários para remover qualquer tecido adiposo ou partes dos ovidutos que possam estar aderidas ao tecido ovariano antes de colocar os ovários em tubos com tampão. Prossiga imediatamente para as técnicas TRAP ou INTACT.
NOTA: Este protocolo não foi otimizado para uso com tecido congelado. O uso de um ovário do mesmo camundongo para cada técnica é recomendado para futuras análises estatísticas.
2. Isolamento de núcleos de tipos específicos de células ovarianas
- Preparação do tampão
- Tampão de purificação nuclear (NPB): Para preparar 100 mL de NPB, combinar 2 mL de 1 M HEPES (concentração final: 20 mM HEPES), 0,8 mL de NaCl 5 M (NaCl 40 mM), 4,5 mL de KCl 2 M (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 mL de água livre de nucleases. Suplementação com 1x inibidor de protease no dia do isolamento dos núcleos.
NOTA: O NPB pode ser preparado sem o inibidor de protease com antecedência e dura até 3 semanas a 4 °C. - Tampão de lise de núcleos (completo): Complemento de tampão de lise de núcleos com 1x inibidor de protease no dia do isolamento dos núcleos.
- Tampão de purificação nuclear (NPB): Para preparar 100 mL de NPB, combinar 2 mL de 1 M HEPES (concentração final: 20 mM HEPES), 0,8 mL de NaCl 5 M (NaCl 40 mM), 4,5 mL de KCl 2 M (90 mM KCl), 0,4 mL de 0,5 M EDTA (2 mM EDTA), 0,1 mL de 0,5 M EGTA (0,5 mM EGTA), e 92,2 mL de água livre de nucleases. Suplementação com 1x inibidor de protease no dia do isolamento dos núcleos.
- Criação dos núcleos de suspensão
NOTA: As amostras devem ser mantidas sempre congeladas, salvo indicação em contrário.- Recolher um ovário de um rato Cyp17-NuTRAP (ou outro Cre-NuTRAP relevante) em 500 μL de tampão de lise nuclear (completo). Pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando micro tesouras de abertura automática.
- Use pontas de pipeta de furo largo para transferir o ovário picado e 500 μL de tampão de lise em um homogeneizador de vidro Dounce no gelo. Homogeneizar o ovário 10x-20x com o pilão solto A. Adicionar 400 μL de tampão de lise ao homogeneizador Dounce, lavando o pilão A.
- Homogeneizar o ovário com o pilão B apertado 10x-20x. Adicionar 1.000 μL de tampão de lise, lavando o pilão B. Transfira o homogeneizado (1,9 mL) para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
- Centrifugar a 200 x g por 1,5 min a 4 °C para remover tecidos e vasos sanguíneos indissociados14. O sobrenadante contém os núcleos; Descarte o pellet de tecido indissociado.
- Após pré-umedecer um filtro celular de 30 μm com 100 μL de tampão de lise, e filtrar o sobrenadante através do filtro celular em um tubo cônico de 15 mL. Em seguida, transfira a mistura contendo núcleos para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
- Centrifugar a amostra a 500 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar o sobrenadante. O pellet contém núcleos.
- Ressuspender a pelota nuclear em 250 μL de tampão de lise gelado por vórtice brevemente a velocidade moderada a alta. Aumentar o volume até 1,75 ml adicionando 1,5 ml de tampão de lise. Misture delicadamente e apoie a suspensão nuclear no gelo por 5 min.
- Pellet os núcleos por centrifugação a 500 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar a pelota nuclear. Ressuspenda a pelota em 200 μL de tampão de armazenamento gelado e vomite brevemente para ressuspender completamente a pelota nuclear.
- Reserve 10% do pellet ressuspendido (20 μL) como amostra de núcleos de entrada para análises a jusante.
- Pegue o pellet de núcleos ressuspensos e perfaça o volume para 2,0 mL com NPB gelado. Proceder ao isolamento dos núcleos marcados usando o método de purificação baseado em afinidade INTACT.
- Isolamento de núcleos marcados em tipos celulares específicos (INTACTOS)
- Vórtice as contas de estreptavidina no frasco para injetáveis durante 30 s a uma velocidade média para garantir que estão totalmente ressuspensas. Adicionar 30 μL de contas ressuspensas para cada amostra em um tubo de fundo redondo de 2 mL (contas para até 10 amostras podem ser lavadas em um único tubo), adicionar 1 mL de NPB e ressuspender bem por pipetagem.
- Coloque o tubo no rack magnético por 1 min para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã. Ressuspender as esferas magnéticas lavadas em 1 mL de NPB.
- Repita a etapa de lavagem para um total de três lavagens. Após a lavagem final, ressuspender as esferas no volume inicial de NPB (30 μL por amostra).
- Adicionar 30 μL das esferas lavadas à suspensão nuclear de 2 ml a partir do passo 2.2.10. Ressuspenda bem a mistura de talão e núcleos pipetando e invertendo suavemente o tubo.
- Coloque os tubos em um misturador rotativo em uma câmara fria ou geladeira por 30 min em baixa velocidade. Incubar as amostras de entrada sem contas nas mesmas condições.
- Coloque os tubos com a suspensão nuclear e as contas sobre o ímã e separe os núcleos biotinilados ligados às esferas de estreptavidina (fração positiva) da fração negativa dos núcleos. Deixe as contas se separarem no ímã por 3 min.
- Retire o sobrenadante, passe a fração negativa para um tubo fresco de 2,0 mL e reserve no gelo. Para cada tubo de fração positivo, remova o tubo do ímã e ressuspenda o conteúdo em 1 mL de NPB.
- Coloque o tubo no ímã por 1 min e descarte o sobrenadante. Retire o tubo do ímã e ressuspenda a mistura de núcleos de contas lavada em 1 mL de NPB.
- Repetir o passo 2.3.8 para um total de três lavagens. Após a conclusão de três lavagens, ressuspender a mistura de núcleos fracionados positivos em 30 μL de NPB.
- Para cada tubo de fracção negativa, centrifugar a suspensão nuclear a partir do passo 2.3.7 a 500 x g durante 7 min a 4 °C. Aspirar e descartar cuidadosamente o sobrenadante. Ressuspender a pastilha dos núcleos fracionários negativos em 30 μL de NPB.
- Conservar os núcleos a partir da entrada (passo 2.2.9), a fracção negativa (passo 2.3.10) e a fracção positiva (passo 2.3.9) num congelador de −80 °C até estarem prontos para o isolamento de ADN ou ARN nuclear.
NOTA: Os núcleos não devem ser congelados para protocolos que exijam núcleos intactos como entrada (ou seja, ensaio para cromatina acessível à transposase, imunoprecipitação de cromatina).
3. Isolamento de RNAm de tipos específicos de células ovarianas
- Preparando os buffers
- Base tampão TRAP: Preparar 100 mL de base tampão TRAP combinando 78,8 mL de água livre de RNase, 5 mL de Tris-HCl 1 M (concentração final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 5 mL de KCl 2 M (KCl 100 mM), 1,2 mL de 1 M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C até 1 mês.
- Base tampão salina alto: Preparar 100 mL de base tampão salina alta combinando 68,8 mL de água livre de RNase, 5 mL de Tris-HCl 1 M (concentração final: 50 mM Tris [pH 7,5]), 15 mL de KCl 2 M (KCl 300 mM), 1,2 mL de 1M MgCl 2 (12 mM MgCl2) e 10 mL de 10% NP-40 (1% NP-40). Conservar a 4 °C até 1 mês.
- Tampão de homogeneização TRAP (completo): Preparar 1,5 mL por amostra no dia da coleta do tecido. Preparar 10 ml de tampão de homogeneização TRAP combinando 10 ml de tampão base TRAP (do passo 3.1.1) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/ml (concentração final: 100 μg/ml cicloheximida), 10 mg de heparina sódica (1 mg/ml de heparina sódica), 20 μL de TDT 0,5 M (TDT 1 mM), 50 μL de inibidor de RNase 40 U/μL (inibidor de 200 U/mL de RNase), 200 μL de espermidina 0,1 M (espermidina 2 mM) e um comprimido inibidor de protease livre de EDTA (1x).
- Tampão de lavagem com baixo teor de sal (completo): Fazer 1,5 mL por amostra no dia da coleta do tecido. Para fazer 10 ml de tampão de lavagem com baixo teor de sal, combinar 10 ml de tampão base TRAP (do passo 3.1.1) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/ml (cicloheximida 100 μg/ml) e 20 μL de TDT 0,5 M (TDT 1 mM).
- Tampão de lavagem com alto teor de sal (completo): Fazer 1,5 mL por amostra no segundo dia de isolamento do TRAP. Para fazer 10 mL de tampão de lavagem com alto teor de sal, combinar 10 mL de tampão base de sal alto (da etapa 3.1.2) com 10 μL de cicloheximida 100 mg/mL e 20 μL de TDT 0,5 M.
- Realizando a purificação de afinidade do ribossomo (TRAP)
- Recolher o outro ovário de um rato Cyp17-NuTRAP (ou outro Cre-NuTRAP relevante) e colocá-lo num tubo sem RNase de 1,5 ml contendo 100 μL de tampão de homogeneização TRAP gelado (do passo 3.1.3). Pique o ovário em oito partes dentro do tampão usando micro tesouras de abertura automática.
- Use pontas largas para transferir o ovário e 100 μL de tampão de homogeneização para um homogeneizador Dounce de vidro. Homogeneizar 10x-20x com o pilão solto A. Adicionar 400 μL de tampão de homogeneização TRAP, lavando o pilão A.
- Transfira o homogeneizado para um tubo de fundo redondo de 2 mL. Lavar o homogeneizador Dounce com mais 1 ml de tampão de homogeneização TRAP e transferir o volume lavado para o tubo de fundo redondo de 2 ml.
- Centrifugar o homogeneizado a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Transfira o sobrenadante limpo para um tubo de fundo redondo fresco de 2 mL. Descarte o pellet.
- Transfira 100 μL do homogeneizado limpo para um tubo de fundo redondo fresco de 2 mL e reserve como entrada no gelo.
- Incubar o resto do homogeneizado eliminado (a partir do passo 3.2.4) com um anticorpo anti-GFP (5 μg/ml) durante 1 h a 4 °C enquanto gira a extremidade sobre a extremidade. Incubar a amostra de entrada nas mesmas condições.
- Nos últimos 15 min da incubação, lavar as esferas magnéticas da proteína G no tampão de lavagem com baixo teor de sal utilizando os seguintes passos (3.2.8-3.2.11).
- Vórtice o frasco de grânulos magnéticos de proteína G por 30 s para ressuspender completamente. Transfira 50 μL das esferas magnéticas da proteína G para cada amostra (até 10 amostras podem ser lavadas em um tubo) para um tubo de fundo redondo de 2 mL.
- Adicione 500 μL de tampão de lavagem com pouco sal às contas e pipete suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 min para coletar as contas contra o lado do tubo. Retire e descarte o sobrenadante.
- Retire o tubo do suporte magnético e adicione 1 mL de tampão de lavagem com sal baixo ao tubo. Pipetar suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético por 1 min para coletar as contas contra o lado do tubo. Retire e descarte o sobrenadante.
- Repetir o passo 3.2.10 para um total de três lavagens. Após a lavagem final, retire o tubo do rack magnético e ressuspenda as esferas no volume inicial de tampão de lavagem com baixo teor de sal (50 μL por amostra).
- Transfira as esferas lavadas ressuspensas (50 μL) para a mistura de amostras de antigénio/anticorpos e incube a 4 °C durante a noite enquanto gira num misturador de ponta a ponta. Incubar as amostras de entrada girando de ponta a ponta a 4 °C durante a noite para manter condições equivalentes.
- Após a incubação durante a noite, remova os tubos do rotador e separe as esferas magnéticas com os ribossomos/RNA alvo (fração positiva) do sobrenadante (fração negativa) usando o suporte magnético por 2,5-3 min. Aspirar a fração negativa, colocá-la em um tubo de fundo redondo de 2 mL e colocá-la de lado no gelo enquanto processa a fração positiva.
- Adicionar 500 μL de tampão de lavagem com sal elevado (do passo 3.1.5) ao tubo com a fracção positiva e pipetar suavemente para misturar. Coloque o tubo em um suporte magnético mantido no gelo por 1 min para separar as contas. Descarte o sobrenadante e remova o tubo do ímã.
- Repetir o passo 3.2.14 para um total de três lavagens. Após a lavagem final, ressuspender as esferas em 350 μL de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 μL de 2-mercaptoetanol (BME). Incubar os tubos à temperatura ambiente enquanto mistura durante 10 min a 900 rpm num agitador digital.
- Separe as esferas da solução que agora contém os ribossomos/RNA alvo com um suporte magnético por 1 min à temperatura ambiente. Coletar a fração positiva eluída (sobrenadante) em um tubo fresco de 1,5 mL e adicionar 350 μL de etanol a 100%. Inverter para misturar. Prossiga para o isolamento de RNA.
- Opcional: Para isolar o ARN da amostra de entrada (passo 3.2.5) e da fracção negativa (passo 3.2.13), transfira 100 μL das fracções de entrada e negativas para tubos frescos de 1,5 ml. Adicionar 350 μL de tampão de lise de RNA suplementado com 3,5 μL de BME a cada amostra. Inverter para misturar. Adicione 250 μL de etanol a 100% a cada tubo e inverta para misturar. Prossiga para o isolamento de RNA.
- Isolamento de RNA
- Transferir 700 μL da fração positiva e, opcionalmente, da fração de entrada e/ou negativa para uma coluna de spin de RNA. Siga as instruções do fabricante para isolar o RNA da coluna de rotação.
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Representative Results
Um esquema dos protocolos TRAP e INTACT é mostrado na Figura 1. Aqui, a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP para células estromais/tecais ovarianas é demonstrada por imagem imunofluorescente e RNA-Seq a partir de RNA isolado por TRAP. Primeiramente, foram realizadas imagens de imunofluorescência do sinal da eGFP no ovário e localização do sinal da eGFP para as células da teca e do estromal. Resumidamente, cortes de 5 μm foram desparafinizados com gradiente de xileno e etanol. Para melhor sinalização da eGFP, a proteína eGFP foi corada usando o anticorpo primário anti-GFP de cabra e o anticorpo secundário anti-cabra de burro Alexa 488, e os núcleos foram corados com DAPI15. As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência com aumento de 20x (Figura 2A). Em seguida, o TRAP foi realizado em ovários de camundongos Cyp17-NuTRAP de 4 meses de idade para isolar o RNA ligado ao ribossomo especificamente das células teca/estromais. O RNA isolado do TRAP (fração positiva) e o RNA de tecido total (entrada) foram usados para construir bibliotecas de sequenciamento de RNA encalhado para sequenciamento em um sequenciador de próxima geração. Foram realizados corte, alinhamento e normalização do RNA-Seq (DESeq2), conforme descrito anteriormente 7,8. A análise de componentes principais (ACP) mostrou forte separação da entrada e fração positiva no primeiro componente, sugerindo perfis transcriptômicos distintos (Figura 2B). Houve 2.009 genes diferencialmente expressos entre as frações de entrada e positivas, como visto no gráfico do vulcão (teste t pareado, correção de teste múltiplo de Benjamini-Hochberg FDR < 0,05, mudança de dobra >2; Figura 2C). Dos genes diferencialmente expressos, observou-se o enriquecimento de marcadores de células estromais e tecais (Col3a1, Star, Fbn1, C1s) e a depleção dos genes oócito (Gdf9, Oosp1, Ooep), granulosa (Amhr2, Serpine2, Eml5), imune (C1qa, C1qb, Fcerg1) e de células musculares lisas (Mfap5)16 (Figura 2D).
Figura 1: Isolamento de núcleos específicos do tipo celular e mRNA do modelo Cyp17-NuTRAP usando os métodos INTACT e TRAP. (A) A geração da linha Cyp17-NuTRAP é obtida através do cruzamento de uma fêmea de flox/flox NuTRAP com um macho Cyp17iCre+/+ . (B) Esquema das metodologias TRAP e INTACT para isolar núcleos e polissomos das células estromais/tecais do camundongo Cyp17-NuTRAP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Validação do modelo de mouse Cyp17-NuTRAP. (A) A imunofluorescência foi realizada nos ovários parafinizados de camundongos Cyp17-Cre+/−NuTRAP flox/WT e Cyp17-Cre−/−NuTRAPflox/WT. A proteína eGFP foi corada usando anticorpo primário anti-GFP de cabra e anticorpo secundário anti-cabra anti-burro Alexa 488, e os núcleos foram corados com DAPI. As imagens foram obtidas em microscópio de fluorescência com aumento de 20x. (B-D) O RNA da fração positiva para entrada e TRAP foi isolado de ovários de camundongos Cyp17-Cre+/−NuTRAPflox/WT (n = 4), usados para preparar bibliotecas de RNA-Seq encalhados, como feito anteriormente7, e sequenciados de forma pareada. Foram realizados corte, alinhamento e normalização do RNA-Seq (DESeq2), como previamente realizado 7,8. (B) A análise de componentes principais (ACP) de todos os genes expressos mostrou uma separação da entrada TRAP e frações positivas no primeiro componente (51,4% explicaram a variância). (C) Gráfico vulcânico de genes diferencialmente expressos entre as frações de entrada e positivas (teste t pareado, correção de teste múltiplo de Benjamini-Hochberg FDR < 0,05, mudança de dobra >2). (D) A comparação da fração positiva do TRAP com a entrada (log2[mudança de dobra ([fração ositiva/Entrada)]) mostrou um enriquecimento global dos genes marcadores de células estromais/tecas e a depleção dos genes marcadores de ovócitos, granulosas, imunes e células musculares lisas (SMC) na fração positiva do TRAP (teste t pareado de razão, correção de teste múltiplo de Benjamini-Hochberg FDR < 0,10, n = 4). As barras representam a média log2[fold change (fração positiva/entrada)] ± MEV. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O modelo de camundongo NuTRAP6 é uma poderosa abordagem de marcação transgênica para a interrogação pareada do transcriptoma e epigenoma de tipos celulares específicos que podem ser adaptados a qualquer tipo de célula com um driver Cre disponível. Aqui, demonstramos a especificidade do modelo de camundongo Cyp17-NuTRAP em atingir tecas ovarianas e células estromais. O modelo Cyp17-NuTRAP pode ser usado para elucidar ainda mais os mecanismos epigenéticos específicos da teca e da célula estromal envolvidos no envelhecimento ovariano, câncer e doença.
Ao selecionar um driver Cre, recomenda-se validar a especificidade celular da expressão NuTRAP mediada por Cre usando várias abordagens ortogonais. O Cyp17a1-Cre é constitutivamente expresso. O modelo NuTRAP também pode ser cruzado com linhas Cre induzíveis para evitar a expressão transitória de genes em células não-alvo durante o desenvolvimento. Como a maioria das células ovarianas é altamente sensível às flutuações hormonais, o estadiamento do ciclo estral também deve ser considerado17.
A abordagem NuTRAP tem muitos benefícios quando comparada às técnicas tradicionais de classificação celular. Primeiro, as técnicas de classificação celular dependem da criação de suspensões unicelulares, que podem causar a indução de artefatos de ativação ex vivo 8. Além disso, a classificação celular depende de marcadores de superfície celular, que podem mudar com a idade ou estados de doença, colocando em questão se as populações de células que estão sendo comparadas entre dois grupos experimentais são realmente equivalentes. A marcação de marcadores de superfície celular também depende da identificação de anticorpos confiáveis para imunomarcação18.
Na última década, houve uma expansão nas técnicas transcriptômicas unicelulares/núcleos 19,20,21,22,23 e epigenômicas24,25,26 para explorar a heterogeneidade das populações celulares. Embora essas abordagens tenham levado a uma maior apreciação da heterogeneidade celular, muitas vezes sofrem com a falta de sensibilidade e cobertura genômica, o que pode limitar a profundidade das análises. Por exemplo, as técnicas de transcriptômica de célula única (scRNA) detectam apenas ~1.000-5.000 genes por célula27, enquanto a técnica NuTRAP usada neste estudo detectou 14.980 genes. Além disso, várias técnicas de scRNA utilizam a marcação 3' ou 5' 20,21,22,28,29,30, o que não permite a análise de isoformas específicas de RNA disponíveis pela metodologia TRAP-seq.
Enquanto a transcriptômica de célula única tornou-se comum na biologia molecular (revisada em Aldridge e Teichmann31), o campo epigenético ficou para trás. A maioria das técnicas epigenômicas de célula única baseia-se na deposição de células ou técnicas microfluídicas de FACS seguidas de preparação de bibliotecas a partir de células únicas. Como tal, o rendimento para técnicas epigenômicas de célula única é geralmente menor do que para os métodos de encapsulamento de gotículas comumente usados para RNA-Seq32 de célula única. A recente adição de um ensaio de célula única (sc) ou núcleo único (sn) para cromatina transponível acessível (ATAC-Seq) à família genômica 10x de soluções unicelulares representa o primeiro método baseado em gotículas que permite a interrogação de um endpoint epigenômico (acessibilidade à cromatina) em resolução de célula única. Técnicas de multiplexação, como o CoBATCH-Seq24 para modificações de histonas, aumentaram drasticamente a taxa de transferência, mas não ao nível de abordagens baseadas em gotículas. O sequenciamento metílico de núcleos únicos (snmC-Seq) foi realizado usando a classificação de núcleos ativados por fluorescência em poços individuais e preparação da biblioteca BS-Seq25,26. No entanto, a conversão severa de bissulfato leva a uma cobertura genômica esparsa, o que requer grande ligação genômica durante a análise de dados (~100 kb) e faz com que o contexto genômico necessário para tirar conclusões científicas robustas seja perdido. O modelo de camundongo NuTRAP permite a análise sensível do epigenoma e transcriptoma de tipos celulares específicos.
Em relação ao procedimento TRAP, existem algumas considerações para garantir o sucesso do isolamento. Primeiro, o ovário deve ser cortado antes da homogeneização, a fim de romper a membrana externa e permitir a dissociação completa. O ovário é um tecido fibroso, especialmente em camundongos mais velhos, dificultando a homogeneização total. Entretanto, durante a otimização deste protocolo, a homogeneização agressiva durante o protocolo TRAP resultou na contaminação dos isolados de RNA, com bandas visíveis de DNA exibidas por eletroforese capilar. Para resolver esse problema, espermidina 2 mM foi incluída no tampão de homogeneização TRAP para estabilizar a membrana nuclear33. Além disso, homogeneizamos apenas as amostras de TRAP com o pilão A solto para evitar o rompimento da membrana nuclear. É importante verificar as amostras de RNA em um Bioanalyzer ou TapeStation após o isolamento para garantir um número de integridade de RNA >7 antes de prosseguir para aplicações de sequenciamento.
Para o procedimento INTACTO, o ovário também deve ser cortado antes da homogeneização. Além disso, verificamos que um spin curto e de baixa rotação (200 x g por 1,5 min) após a homogeneização é eficaz para remover tecidos e vasos sanguíneos indissociados, como foi feito anteriormente 7,14. Se o RNA nuclear for um desfecho desejado, um inibidor de RNase deve ser incluído nos buffers INTACTOS. RNA-Seq nuclear ou RT-qPCR podem ser usados para testar a especificidade celular dos isolamentos INTACTOS. As esferas de estreptavidina têm uma afinidade incrivelmente alta pela biotina, tornando difícil separar as esferas dos núcleos de biotina+ seguindo o protocolo INTACT, e isso deve ser considerado ao planejar aplicações a jusante. Além de isolar núcleos específicos do tipo de célula de modelos NuTRAP usando INTACT, os núcleos também podem ser classificados com base na expressão de eGFP para aplicações downstream. O procedimento INTACT para isolar núcleos pode ser usado para avaliar vários desfechos, incluindo transcriptômica nuclear, epigenômica e proteômica.
As técnicas citadas são ótimas ferramentas para a avaliação do envelhecimento ovariano. O envelhecimento ovariano é uma preocupação não só do ponto de vista reprodutivo, mas também do ponto de vista da saúde. A menopausa, que é a cessação da função ovariana, está associada à aceleração dos relógios biológicos34, e a menopausa precoce está associada a uma menor expectativa de vida e maior risco de doenças em mulheres35,36. Sabe-se que o envelhecimento oocitário está diretamente relacionado ao declínio da aptidão ovariana. No entanto, acredita-se que outros tipos celulares também desempenhem papéis no declínio da saúde ovariana e no aumento da senescência e inflamação ovarianas37. Uma melhor compreensão de quais células estão envolvidas nesse processo e como retardá-lo é fundamental. Embora existam diferenças inegáveis entre a dinâmica ovariana humana e murina, os modelos de camundongos continuam sendo ferramentas importantes para investigar a biologia ovariana. Nesse contexto, os modelos Cre-NuTRAP podem ser ferramentas úteis para identificar os alvos de tipos celulares mais eficazes para tentativas de retardar o envelhecimento ovariano e a menopausa.
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Este trabalho também foi apoiado em parte pelo prêmio MERIT I01BX003906 e um prêmio do Programa de Avaliação de Equipamentos Compartilhados (ShEEP) ISIBX004797 dos Estados Unidos (EUA). Departamento de Assuntos de Veteranos, Serviço de Pesquisa e Desenvolvimento de Laboratórios Biomédicos. Os autores também gostariam de agradecer ao Clinical Genomics Center (OMRF) e ao Imaging Core Facility (OMRF) pela assistência e uso do instrumento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre - Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre - Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP - Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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