माउस डिम्बग्रंथि एपिजीनोम और ट्रांसक्रिपटम की सेल-विशिष्ट युग्मित पूछताछ
Summary
इस प्रोटोकॉल में, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (टीआरएपी) विधि और विशिष्ट सेल प्रकारों (INTIN) विधि में टैग किए गए नाभिक के अलगाव को कोशिका-विशिष्ट डिम्बग्रंथि प्रतिलेख और एपिजीनोम की युग्मित पूछताछ के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसमें NuTRAP माउस मॉडल का उपयोग करके Cyp17a1-Cre माउस लाइन को पार किया गया था।
Abstract
सेल-प्रकार-विशिष्ट एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों का आकलन डिम्बग्रंथि की उम्र बढ़ने को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके लिए, अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (टीआरएपी) विधि का अनुकूलन और विशिष्ट सेल प्रकारों (INT) विधि में टैग किए गए नाभिक के अलगाव को एक नए ट्रांसजेनिक न्यूट्रैप माउस मॉडल का उपयोग करके सेल-विशिष्ट डिम्बग्रंथि ट्रांसस्क्रिप्टम और एपिजीनोम की बाद की युग्मित पूछताछ के लिए किया गया था। न्यूट्रैप एलील की अभिव्यक्ति एक फ्लोक्स्ड स्टॉप कैसेट के नियंत्रण में है और प्रमोटर-विशिष्ट सीआरई लाइनों का उपयोग करके विशिष्ट डिम्बग्रंथि सेल प्रकारों को लक्षित किया जा सकता है। चूंकि हाल के अध्ययनों ने डिम्बग्रंथि स्ट्रोमल कोशिकाओं को समय से पहले उम्र बढ़ने वाले फेनोटाइप ्स को चलाने में फंसाया है, इसलिए न्यूट्रैप अभिव्यक्ति प्रणाली को Cyp17a1-Cre ड्राइवर का उपयोग करके स्ट्रोमल कोशिकाओं को लक्षित किया गया था। न्यूट्रैप निर्माण का प्रेरण डिम्बग्रंथि स्ट्रोमल फाइब्रोब्लास्ट के लिए विशिष्ट था, और अनुक्रमण अध्ययन के लिए पर्याप्त डीएनए और आरएनए एक अंडाशय से प्राप्त किए गए थे। यहां प्रस्तुत न्यूट्रैप मॉडल और विधियों का उपयोग उपलब्ध सीआरई लाइन के साथ किसी भी डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
अंडाशय दैहिक उम्र बढ़ने में प्रमुख खिलाड़ी हैं1, विशिष्ट कोशिका आबादी से अलग-अलग योगदान के साथ। अंडाशय की सेलुलर विषमता थोक, पूरे-अंडाशय परख से आणविक परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल बनाती है। डिम्बग्रंथि की उम्र बढ़ने में विशिष्ट कोशिका आबादी की भूमिका को समझना वृद्ध महिलाओं में प्रजनन क्षमता और स्वास्थ्य गिरावट के लिए जिम्मेदार आणविक ड्राइवरों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। परंपरागत रूप से, विशिष्ट डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकारों का बहु-ओमिक्स मूल्यांकन लेजर माइक्रोडिसेक्शन2, एकल-कोशिका दृष्टिकोण3, या सेल सॉर्टिंग4 जैसी तकनीकों द्वारा प्राप्त किया गया था। हालांकि, माइक्रोडिसेक्शन महंगा और प्रदर्शन करने में मुश्किल हो सकता है, और सेल सॉर्टिंग सेलुलर फेनोटाइपिक प्रोफाइल5 को बदल सकती है।
डिम्बग्रंथि सेल-प्रकार-विशिष्ट एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइल का आकलन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण परमाणु टैगिंग और राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (एनयूटीएपी) माउस मॉडल का अनुवाद करता है। न्यूट्रैप मॉडल आत्मीयता शोधन विधियों का उपयोग करके सेल सॉर्टिंग की आवश्यकता के बिना सेल-प्रकार-विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड के अलगाव की अनुमति देता है: राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) और विशिष्ट सेल प्रकारों (INT)6 में टैग किए गए नाभिक के अलगाव का अनुवाद करना। न्यूट्रैप एलील की अभिव्यक्ति एक फ्लोक्स्ड स्टॉप कैसेट के नियंत्रण में है और प्रमोटर-विशिष्ट सीआरई लाइनों का उपयोग करके विशिष्ट डिम्बग्रंथि सेल प्रकारों को लक्षित किया जा सकता है। सेल-टाइप-विशिष्ट क्रे लाइन के साथ न्यूट्रैप माउस को पार करके, स्टॉप कैसेट को हटाने से राइबोसोमल कॉम्प्लेक्स की ईजीएफपी-टैगिंग और क्रे-निर्भरतरीके से नाभिक की बायोटिन / एमचेरी-टैगिंग होती है। ट्रैप और इंटीग्रेट तकनीकों का उपयोग तब एमआरएनए और परमाणु डीएनए को सेल प्रकार की रुचि से अलग करने और ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक विश्लेषण के लिए आगे बढ़ने के लिए किया जा सकता है।
न्यूट्रैप मॉडल का उपयोग विभिन्न ऊतकों में किया गया है, जैसे कि वसा ऊतक 6, मस्तिष्क ऊतक 7,8,9, और रेटिना10, सेल-प्रकार-विशिष्ट एपिजेनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक परिवर्तनों को प्रकट करने के लिए जो पूरे ऊतक होमोजेनेट में पता नहीं लगाया जा सकता है। पारंपरिक सेल सॉर्टिंग तकनीकों पर न्यूट्रैप दृष्टिकोण के लाभों में निम्नलिखित शामिल हैं: 1) पूर्व विवो सक्रियण कलाकृतियों की रोकथाम8, 2) विशेष उपकरणों (यानी, सेल सॉर्टर) की कम से कम आवश्यकता, और 3) सेल-प्रकार-विशिष्ट विश्लेषण ों की बढ़ी हुई थ्रूपुट और कम लागत। इसके अलावा, एक माउस से सेल-प्रकार-विशिष्ट डीएनए और आरएनए को अलग करने की क्षमता युग्मित विश्लेषण के लिए अनुमति देती है जो सांख्यिकीय शक्ति को बढ़ाती है। चूंकि हाल के अध्ययनों ने डिम्बग्रंथि स्ट्रोमल कोशिकाओं को समय से पहले उम्र बढ़ने वालेफेनोटाइप्स 11,12,13 को चलाने में फंसाया है, इसलिए हमने Cyp17a1-Cre ड्राइवर का उपयोग करके स्ट्रोमल और थेका कोशिकाओं के लिए NuTRAP अभिव्यक्ति प्रणाली को लक्षित किया। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि न्यूट्रैप निर्माण का प्रेरण डिम्बग्रंथि स्ट्रोमल और थेका कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है, और अनुक्रमण अध्ययन के लिए पर्याप्त डीएनए और आरएनए एक अंडाशय से प्राप्त किए जाते हैं। यहां प्रस्तुत न्यूट्रैप मॉडल और विधियों का उपयोग किसी भी उपलब्ध सीआरई लाइन के साथ किसी भी डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकार का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
सेल-प्रकार-विशिष्ट डिम्बग्रंथि न्यूट्रैप माउस लाइन की पीढ़ी के लिए, परमाणु टैगिंग और अनुवाद राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (एनयूटीएपी) एलील में एक फ्लोक्स्ड स्टॉप कोडन होता है जो बीरा, बायोटिन लिगेज रिकॉग्निशन पेप्टाइड (बीएलआरपी) -टैग किए गए एमचेरी / एमआरएनएजीएपी 1, और ईजीएफपी / एल 10 ए की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है। जब सेल-प्रकार-विशिष्ट क्रे लाइन के साथ पार किया जाता है, तो न्यूट्रैप कैसेट की अभिव्यक्ति परमाणु प्रोटीन mRANGAP1 को बायोटिन / एमचेरी और राइबोसोमल प्रोटीन L10a को ईजीएफपी के साथ सीआरई-निर्भर तरीके से लेबल करती है। यह सेल सॉर्टिंग की आवश्यकता के बिना विशिष्ट सेल प्रकारों से नाभिक और एमआरएनए के अलगाव की अनुमति देता है। फ्लोक्स को इसका आकलन करने के लिए डिम्बग्रंथि कोशिका प्रकारों से संबंधित सेल-प्रकार-विशिष्ट सीआरई के साथ जोड़ा जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAP माउस मॉडल6 विशिष्ट सेल प्रकारों से ट्रांसस्क्रिप्टम और एपिजीनोम की युग्मित पूछताछ के लिए एक शक्तिशाली ट्रांसजेनिक लेबलिंग दृष्टिकोण है जिसे उपलब्ध सीआरई ड्राइवर के साथ किसी भी सेल प्रका…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) (आर01एजी070035, आर01एजी069742, टी32एजी052363), ब्राइटफोकस फाउंडेशन (एम2020207) और प्रेस्बिटेरियन हेल्थ फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को मेरिट पुरस्कार I01BX003906 और संयुक्त राज्य अमेरिका (यू.एस.) से एक साझा उपकरण मूल्यांकन कार्यक्रम (SHEEP) पुरस्कार ISIBX004797 द्वारा भी समर्थित किया गया था। वयोवृद्ध मामलों के विभाग, बायोमेडिकल प्रयोगशाला अनुसंधान और विकास सेवा। लेखक सहायता और उपकरण उपयोग के लिए क्लिनिकल जीनोमिक्स सेंटर (ओएमआरएफ) और इमेजिंग कोर फैसिलिटी (ओएमआरएफ) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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