Interrogazione accoppiata cellula-specifica dell'epigenoma ovarico e del trascrittoma ovarico del topo
Summary
In questo protocollo, il metodo di purificazione dell’affinità dei ribosomi traslanti (TRAP) e l’isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) sono stati ottimizzati per l’interrogazione accoppiata del trascrittoma ovarico e dell’epigenoma specifici della cellula utilizzando il modello murino NuTRAP incrociato su una linea murina Cyp17a1-Cre.
Abstract
La valutazione dei cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula è fondamentale per comprendere l’invecchiamento ovarico. A tal fine, è stata eseguita l’ottimizzazione del metodo di purificazione dell’affinità ribosomiale traslante (TRAP) e l’isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) per il successivo interrogatorio accoppiato del trascrittoma ovarico e dell’epigenoma cellula-specifici utilizzando un nuovo modello murino NuTRAP transgenico. L’espressione dell’allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce, il sistema di espressione NuTRAP è stato mirato alle cellule stromali utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. L’induzione del costrutto NuTRAP era specifica per i fibroblasti stromali ovarici e da una singola ovaia sono stati ottenuti DNA e RNA sufficienti per studi di sequenziamento. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con una linea Cre disponibile.
Introduction
Le ovaie sono i principali attori nell’invecchiamento somatico1, con contributi distinti da specifiche popolazioni cellulari. L’eterogeneità cellulare dell’ovaio rende difficile interpretare i risultati molecolari da saggi di massa dell’ovaio intero. Comprendere il ruolo di specifiche popolazioni cellulari nell’invecchiamento ovarico è la chiave per identificare i driver molecolari responsabili della fertilità e del declino della salute nelle donne anziane. Tradizionalmente, la valutazione multi-omica di specifici tipi di cellule ovariche è stata ottenuta con tecniche come la microdissezione laser2, gli approcci a singola cellula3 o la selezione cellulare4. Tuttavia, la microdissezione può essere costosa e difficile da eseguire e la selezione cellulare può alterare i profili fenotipici cellulari5.
Un nuovo approccio per valutare i profili epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula ovarica utilizza il modello murino NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosoma affinity purification). Il modello NuTRAP consente l’isolamento di acidi nucleici specifici del tipo di cellula senza la necessità di selezionare le cellule utilizzando i metodi di purificazione dell’affinità: purificazione dell’affinità ribosomiale traslante (TRAP) e isolamento di nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT)6. L’espressione dell’allele NuTRAP è sotto il controllo di una cassetta STOP floxata e può essere mirata a specifici tipi di cellule ovariche utilizzando linee Cre specifiche del promotore. Incrociando il topo NuTRAP con una linea Cre specifica del tipo di cellula, la rimozione della cassetta STOP provoca l’etichettatura eGFP del complesso ribosomiale e la marcatura biotina/mCherry del nucleo in modo Cre-dipendente6. Le tecniche TRAP e INTACT possono quindi essere utilizzate per isolare mRNA e DNA nucleare dal tipo di cellula di interesse e procedere ad analisi trascrittomiche ed epigenomiche.
Il modello NuTRAP è stato utilizzato in diversi tessuti, come il tessuto adiposo6, il tessuto cerebrale 7,8,9 e la retina10, per rivelare cambiamenti epigenomici e trascrittomici specifici del tipo di cellula che potrebbero non essere rilevati nell’omogenato dell’intero tessuto. I vantaggi dell’approccio NuTRAP rispetto alle tradizionali tecniche di selezione cellulare includono quanto segue: 1) la prevenzione di artefatti di attivazione ex vivo 8, 2) la necessità ridotta al minimo di attrezzature specializzate (ad esempio, selezionatori di cellule) e 3) l’aumento della produttività e la riduzione dei costi delle analisi specifiche del tipo di cellula. Inoltre, la capacità di isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula da un singolo topo consente analisi accoppiate che aumentano il potere statistico. Poiché studi recenti hanno implicato le cellule stromali ovariche nel guidare i fenotipi di invecchiamento precoce 11,12,13, abbiamo mirato il sistema di espressione NuTRAP alle cellule stromali e teca utilizzando un driver Cyp17a1-Cre. Qui, dimostriamo che l’induzione del costrutto NuTRAP è specifica per le cellule stromali e teche ovariche, e DNA e RNA sufficienti per gli studi di sequenziamento sono ottenuti da una singola ovaia. Il modello NuTRAP e i metodi qui presentati possono essere utilizzati per studiare qualsiasi tipo di cellula ovarica con qualsiasi linea Cre disponibile.
Per la generazione di una linea murina NuTRAP ovarica specifica per tipo cellulare, l’allele NuTRAP (nuclear tagging and translating ribosome affinity purification) ha un codone STOP floxed che controlla l’espressione di BirA, peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP)-taggato mCherry/mRANGAP1 e eGFP/L10a. Quando incrociata con una linea Cre specifica per tipo cellulare, l’espressione della cassetta NuTRAP etichetta la proteina nucleare mRANGAP1 con biotina/mCherry e la proteina ribosomiale L10a con eGFP in modo Cre-dipendente. Ciò consente l’isolamento di nuclei e mRNA da specifici tipi di cellule senza la necessità di selezionare le cellule. Ilflox/flox NuTRAP può essere abbinato a un Cre specifico per il tipo di cellula rilevante per i tipi di cellule ovariche per valutare questo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello murino NuTRAP6 è un potente approccio di marcatura transgenica per l’interrogazione accoppiata del trascrittoma e dell’epigenoma da specifici tipi di cellule che possono essere adattati a qualsiasi tipo di cellula con un driver Cre disponibile. Qui, dimostriamo la specificità del modello murino Cyp17-NuTRAP nel colpire la teca ovarica e le cellule stromali. Il modello Cyp17-NuTRAP può essere utilizzato per chiarire ulteriormente i meccanismi epigenetici specifici della teca e delle c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) e Presbyterian Health Foundation. Questo lavoro è stato anche supportato in parte dal premio MERIT I01BX003906 e da un premio Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) ISIBX004797 dagli Stati Uniti (USA). Dipartimento degli affari dei veterani, servizio di ricerca e sviluppo del laboratorio biomedico. Gli autori desiderano inoltre ringraziare il Clinical Genomics Center (OMRF) e l’Imaging Core Facility (OMRF) per l’assistenza e l’utilizzo degli strumenti.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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