マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション
Summary
このプロトコルでは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法と特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、Cyp17a1-Creマウス系統に交配されたNuTRAPマウスモデルを使用して、細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのペアインプロゲーション用に最適化されました。
Abstract
細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を評価することは、卵巣の老化を理解するための鍵です。この目的のために、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法の最適化と特定の細胞型でタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、新しいトランスジェニックNuTRAPマウスモデルを使用した細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのその後のペアインテロゲーションのために行われました。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型の駆動に関与していることが示されているため、NuTRAP発現システムは、Cyp17a1-Creドライバーを使用して間質細胞を標的としました。NuTRAP構築物の誘導は卵巣間質線維芽細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAおよびRNAが単一の卵巣から得られた。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つ任意の卵巣細胞タイプの研究に使用できます。
Introduction
卵巣は体細胞老化の主要なプレーヤーであり1、特定の細胞集団からの明確な寄与があります。卵巣の細胞不均一性は、バルク、全卵巣アッセイからの分子結果を解釈することを困難にします。卵巣の老化における特定の細胞集団の役割を理解することは、高齢女性の生殖能力と健康低下の原因となる分子ドライバーを特定するための鍵です。従来、特定の卵巣細胞タイプのマルチオミクス評価は、レーザーマイクロダイセクション2、シングルセルアプローチ3、またはセルソーティング4などの技術によって達成されていました。しかし、マイクロダイセクションは費用がかかり、実行が困難な場合があり、細胞の選別は細胞の表現型プロファイルを変化させる可能性があります5。
卵巣細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトミクスプロファイルを評価するための新しいアプローチは、核タグ付けおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)マウスモデルを使用します。NuTRAPモデルでは、アフィニティー精製法(翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)および特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)6)を使用することで、細胞ソーティングを必要とせずに細胞種特異的核酸を単離できます。NuTRAP対立遺伝子の発現は、フロックスSTOPカセットの制御下にあり、プロモーター特異的Cre株を使用して特定の卵巣細胞型を標的とすることができます。NuTRAPマウスを細胞型特異的Creラインと交差させることにより、STOPカセットを除去すると、リボソーム複合体のeGFPタグ付けと核のビオチン/mCherryタグ付けがCre依存的に行われます6。次に、TRAPおよびINTACT技術を使用して、目的の細胞型からmRNAおよび核DNAを分離し、トランスクリプトームおよびエピゲノム解析に進むことができます。
NuTRAPモデルは、脂肪組織6、脳組織7、8、9、網膜10などのさまざまな組織で使用されており、全組織ホモジネートでは検出されない可能性のある細胞型特異的なエピゲノムおよびトランスクリプトームの変化を明らかにしています。従来の細胞選別技術に対するNuTRAPアプローチの利点には、1)生体外活性化アーティファクトの防止8、2)特殊な機器(すなわち、細胞選別機)の必要性の最小化、および3)細胞タイプ特異的分析のスループットの向上とコストの削減が含まれます。さらに、1匹のマウスから細胞種特異的なDNAとRNAを単離できるため、統計的検出力を高めるペア分析が可能になります。最近の研究では、卵巣間質細胞が早期老化表現型11,12,13の駆動に関与していることが示されているため、Cyp17a1-Creドライバーを使用してNuTRAP発現系を間質細胞とテカ細胞に標的化しました。ここでは、NuTRAP構築物の誘導が卵巣間質細胞とテカ細胞に特異的であり、シーケンシング研究に十分なDNAとRNAが単一の卵巣から得られることを実証します。ここで紹介するNuTRAPモデルと方法は、利用可能なCre株を持つあらゆる卵巣細胞タイプの研究に使用できます。
細胞型特異的卵巣NuTRAPマウス株の作製のために、核タグおよび翻訳リボソームアフィニティー精製(NuTRAP)対立遺伝子は、BirA、ビオチンリガーゼ認識ペプチド(BLRP)タグ付きmCherry/mRANGAP1、およびeGFP/L10aの発現を制御するフロックスSTOPコドンを有する。細胞型特異的Creラインと交差させると、NuTRAPカセットの発現は核タンパク質mRANGAP1をビオチン/mCherryで標識し、リボソームタンパク質L10aをeGFPでCre依存的に標識します。これにより、細胞選別を必要とせずに、特定の細胞タイプから核およびmRNAを単離することができます。NuTRAPフロックス/フロックス は、卵巣細胞タイプに関連する細胞タイプ特異的Creと組み合わせて、これを評価することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAPマウスモデル6は、利用可能なCreドライバーを使用して任意の細胞タイプに適応できる、特定の細胞タイプからのトランスクリプトームとエピゲノムのペアインベリングのための強力なトランスジェニック標識アプローチです。ここでは、卵巣細胞と間質細胞を標的とするCyp17-NuTRAPマウスモデルの特異性を示します。Cyp17-NuTRAPモデルは、卵巣の老化、癌、および疾患に関…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、国立衛生研究所(NIH)(R01AG070035、R01AG069742、T32AG052363)、ブライトフォーカス財団(M2020207)、および長老派健康財団からの助成金によって支援されました。この作業は、米国(US)のMERIT賞I01BX003906および共有機器評価プログラム(ShEEP)賞ISIBX004797によっても部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス。著者らはまた、臨床ゲノミクスセンター(OMRF)とイメージングコアファシリティ(OMRF)の支援と機器の使用に感謝したいと思います。
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
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