Cellspecifik parad förhör av musens äggstocksepigenom och transkriptom
Summary
I detta protokoll optimerades den översättande ribosomaffinitetsreningsmetoden (TRAP) och isoleringen av kärnor taggade i specifika celltyper (INTACT) -metoden för den parade undersökningen av det cellspecifika äggstockstranskriptomet och epigenomet med hjälp av NuTRAP-musmodellen korsad till en Cyp17a1-Cre-muslinje.
Abstract
Att bedöma celltypspecifika epigenomiska och transkriptomiska förändringar är nyckeln till att förstå åldrande av äggstockarna. För detta ändamål utfördes optimeringen av den översättande ribosomaffinitetsreningsmetoden (TRAP) och isoleringen av kärnor taggade i specifika celltyper (INTACT) -metoden för den efterföljande parade undersökningen av det cellspecifika äggstockstranskriptomet och epigenomet med hjälp av en ny transgen NuTRAP-musmodell. Uttrycket av NuTRAP-allelen kontrolleras av en floxed STOP-kassett och kan riktas mot specifika äggstockscelltyper med hjälp av promotorspecifika Cre-linjer. Eftersom nyligen genomförda studier har involverat stromaceller från äggstockar för att driva för tidigt åldrande fenotyper, riktades NuTRAP-uttryckssystemet mot stromaceller med hjälp av en Cyp17a1-Cre-drivrutin. Induktionen av NuTRAP-konstruktionen var specifik för stromafibroblaster i äggstockarna och tillräckligt med DNA och RNA för sekvenseringsstudier erhölls från en enda äggstock. NuTRAP-modellen och metoderna som presenteras här kan användas för att studera vilken äggstockscelltyp som helst med en tillgänglig Cre-linje.
Introduction
Äggstockarna är viktiga aktörer i somatiskt åldrande1, med tydliga bidrag från specifika cellpopulationer. Äggstockens cellulära heterogenitet gör det svårt att tolka molekylära resultat från bulk-, heläggstocksanalyser. Att förstå rollen som specifika cellpopulationer i åldrande av äggstockar är nyckeln till att identifiera de molekylära drivkrafterna som är ansvariga för fertilitet och hälsonedgång hos äldre kvinnor. Traditionellt uppnåddes multi-omics-bedömningen av specifika äggstockscelltyper genom tekniker som lasermikrodissektion2, encellsmetoder3 eller cellsortering4. Mikrodissektion kan dock vara dyrt och svårt att utföra, och cellsortering kan förändra cellulära fenotypiska profiler5.
Ett nytt tillvägagångssätt för att bedöma äggstockscellstypspecifika epigenomiska och transkriptomiska profiler använder musmodellen NuTRAP (NuTRAP) för kärnmärkning och översättning av ribosomaffinitetsrening. NuTRAP-modellen möjliggör isolering av celltypsspecifika nukleinsyror utan behov av cellsortering med hjälp av affinitetsreningsmetoderna: översättning av ribosomaffinitetsrening (TRAP) och isolering av kärnor taggade i specifika celltyper (INTACT)6. Uttrycket av NuTRAP-allelen kontrolleras av en floxed STOP-kassett och kan riktas mot specifika äggstockscelltyper med hjälp av promotorspecifika Cre-linjer. Genom att korsa NuTRAP-musen med en celltypsspecifik Cre-linje orsakar avlägsnandet av STOP-kassetten eGFP-märkning av ribosomkomplexet och biotin/mCherry-märkning av kärnan på ett Cre-beroende sätt6. TRAP- och INTACT-teknikerna kan sedan användas för att isolera mRNA och kärn-DNA från den aktuella celltypen och gå vidare till transkriptomiska och epigenomiska analyser.
NuTRAP-modellen har använts i olika vävnader, såsom fettvävnad6, hjärnvävnad 7,8,9 och näthinnan10, för att avslöja celltypspecifika epigenomiska och transkriptomiska förändringar som kanske inte detekteras i helvävnadshomogenat. Fördelarna med NuTRAP-metoden jämfört med traditionella cellsorteringstekniker inkluderar följande: 1) förebyggande av ex vivo-aktiveringsartefakter 8, 2) det minimerade behovet av specialutrustning (dvs. cellsorterare) och 3) den ökade genomströmningen och minskade kostnaden för celltypspecifika analyser. Dessutom möjliggör förmågan att isolera celltypspecifikt DNA och RNA från en enda mus parade analyser som ökar den statistiska styrkan. Eftersom nyligen genomförda studier har involverat stromaceller från äggstockarna för att driva för tidigt åldrande fenotyper 11,12,13, riktade vi NuTRAP-uttryckssystemet till stroma- och theca-celler med hjälp av en Cyp17a1-Cre-drivrutin. Här visar vi att induktionen av NuTRAP-konstruktionen är specifik för stroma- och thecaceller från äggstockarna, och tillräckligt med DNA och RNA för sekvenseringsstudier erhålls från en enda äggstock. NuTRAP-modellen och metoderna som presenteras här kan användas för att studera vilken äggstockscelltyp som helst med vilken tillgänglig Cre-linje som helst.
För generering av en celltypsspecifik NuTRAP-muslinje för äggstockar har NuTRAP-allelen (NuTRAP) märkning och översättning av ribosomaffinitetsrening (NuTRAP) ett floxat STOP-kodon som styr uttrycket av BirA, biotinligasigenkänningspeptid (BLRP)-märkt mCherry/mRANGAP1 och eGFP/L10a. När den korsas med en celltypsspecifik Cre-linje märker uttrycket av NuTRAP-kassetten kärnproteinet mRANGAP1 med biotin / mCherry och ribosomalt protein L10a med eGFP på ett Cre-beroende sätt. Detta möjliggör isolering av kärnor och mRNA från specifika celltyper utan behov av cellsortering. NuTRAP-floxen / flox kan paras ihop med en celltypspecifik Cre som är relevant för äggstockscelltyper för att bedöma detta.
Protocol
Representative Results
Discussion
NuTRAP-musmodellen6 är en kraftfull transgen märkningsmetod för parkopplad förhör av transkriptomet och epigenomet från specifika celltyper som kan anpassas till vilken celltyp som helst med en tillgänglig Cre-drivrutin. Här demonstrerar vi specificiteten hos Cyp17-NuTRAP-musmodellen för att rikta in sig på äggstockstheca och stromaceller eller stromaceller. Cyp17-NuTRAP-modellen kan användas för att ytterligare belysa de theca- och stromacellsspecifika epigenetiska mekanismer som är…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health (NIH) (R01AG070035, R01AG069742, T32AG052363), BrightFocus Foundation (M2020207) och Presbyterian Health Foundation. Detta arbete stöddes också delvis av MERIT-utmärkelsen I01BX003906 och en Shared Equipment Evaluation Program (ShEEP) -utmärkelsen ISIBX004797 från USA (USA) Institutionen för veteranfrågor, biomedicinsk laboratorieforskning och utvecklingstjänst. Författarna vill också tacka Clinical Genomics Center (OMRF) och Imaging Core Facility (OMRF) för hjälp och instrumentanvändning.
Materials
| 0.1 M Spermidine | Sigma-Aldrich | 05292-1ML-F | |
| 1 M MgCl2 | Thermo Scientific | AM9530G | |
| 10% NP-40 | Thermo Scientific | 85124 | |
| 100 mg/mL Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C4859-1ML | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| 30 µm cell strainer | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | |
| anti-GFP antibody | Abcam | Ab290 | For TRAP and IHC (Rabbit polyclonal to GFP) |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | RNA Lysis Buffer in protocol |
| cOmplete, mini, EDTA-free protease inhibitor tablet | Roche | 11836170001 | For TRAP Homogenization Buffer |
| Cyp17iCre mouse model | The Jackson Laboratory | 28547 | B6;SJL-Tg(Cyp17a1-icre)AJako/J |
| DynaMag-2 magnet | Invitrogen | 12321D | |
| Genotyping Primers | IDT | Custom | Generic Cre – Jackson Laboratory protocol 22392, Primers: oIMR1084, oIMR1085, oIMR7338, oIMR7339 |
| Cyp17iCre – Jackson Laboratory protocol 30847, Primers: 21218, 31704, 31705, 35663 | |||
| NuTRAP – Jackson Laboratory protocol 21509, Primers: 21306, 24493, 32625, 32626 | |||
| Halt Protease Inhibitor cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861278 | For NPB Buffer |
| M-280 Streptavidin Dynabeads | Invitrogen | 11205D | 2.8 µm bead diameter |
| MixMate | Eppendorf | 5353000529 | |
| Nuclei Isolation Kit: Nuclei EZ Prep | Sigma-Aldrich | Nuc101 | Contains Nuclei Lysis Buffer and Nuclei Storage Buffer |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9760G | |
| 2M KCl | Thermo Scientific | AM9640G | |
| 0.5 M EDTA | Thermo Scientific | AM9260G | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| NuTRAP mouse model | The Jackson Laboratory | 29899 | B6;129S6-Gt(ROSA)26Sortm2(CAG-NuTRAP)Evdr/J |
| Pierce DTT No-Weigh Format | Thermo Scientific | A39255 | |
| Protein G Dynabeads | ThermoFisher | 10004D | For TRAP |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| Sodium Heparin | Fisher Scientific | BP2425 | |
| Ultrapure 1M Tris-HCl, pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | |
| VWR Tube Rotator | Fisher Scientific | NC9854190 |
References
- Broekmans, F. J., Soules, M. R., Fauser, B. C. Ovarian aging: Mechanisms and clinical consequences. Endocrine Reviews. 30 (5), 465-493 (2009).
- Cheng, L., et al. Laser-assisted microdissection in translational research: Theory, technical considerations, and future applications. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 21 (1), 31-47 (2013).
- Morris, M. E., et al. A single-cell atlas of the cycling murine ovary. eLife. 11, 77239 (2022).
- Kendrick, H., et al. Transcriptome analysis of mammary epithelial subpopulations identifies novel determinants of lineage commitment and cell fate. BMC Genomics. 9, 591 (2008).
- Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. Does FACS perturb gene expression. Cytometry A. 87 (2), 166-175 (2015).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Ocanas, S. R., et al. Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia. eNeuro. 9 (2), (2022).
- Raus, A. M., Nelson, N. E., Fuller, T. D., Ivy, A. S. 34;SIT" with Emx1-NuTRAP mice: Simultaneous INTACT and TRAP for paired transcriptomic and epigenetic sequencing. Current Protocols. 2 (10), 570 (2022).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Translatomic response of retinal Muller glia to acute and chronic stress. Neurobiology Disease. 175, 105931 (2022).
- Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259 (2020).
- Briley, S. M., et al. Reproductive age-associated fibrosis in the stroma of the mammalian ovary. Reproduction. 152 (3), 245-260 (2016).
- Umehara, T., et al. Female reproductive life span is extended by targeted removal of fibrotic collagen from the mouse ovary. Science Advances. 8 (24), (2022).
- Lopez-Sanchez, N., Frade, J. M. Cell cycle analysis in the vertebrate brain using immunolabeled fresh cell nuclei. Bio-Protocol. 3 (22), 973 (2013).
- Saccon, T. D., et al. Primordial follicle reserve, DNA damage and macrophage infiltration in the ovaries of the long-living Ames dwarf mice. Experimental Gerontology. 132, 110851 (2020).
- Kinnear, H. M., et al. The ovarian stroma as a new frontier. Reproduction. 160 (3), 25-39 (2020).
- Ajayi, A. F., Akhigbe, R. E. Staging of the estrous cycle and induction of estrus in experimental rodents: an update. Fertility Research and Practice. 6, 5 (2020).
- Tighe, R. M., et al. Improving the quality and reproducibility of flow cytometry in the lung. An official American Thoracic Society workshop report. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 61 (2), 150-161 (2019).
- Zhang, X., et al. Comparative analysis of droplet-based ultra-high-throughput single-cell RNA-Seq systems. Molecular Cell. 73 (1), 130-142 (2019).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8, 14049 (2017).
- Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Prakadan, S. M., Shalek, A. K., Weitz, D. A. Scaling by shrinking: Empowering single-cell ‘omics’ with microfluidic devices. Nature Reviews Genetics. 18 (6), 345-361 (2017).
- Wang, Q., et al. CoBATCH for high-throughput single-cell epigenomic profiling. Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).
- Luo, C., et al. Robust single-cell DNA methylome profiling with snmC-seq2. Nature Communications. 9, 3824 (2018).
- Liu, H., et al. DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution. Nature. 598 (7879), 120-128 (2021).
- Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods for immune cell profiling. BMC Genomics. 22 (1), 66 (2021).
- Hashimshony, T., et al. CEL-Seq2: Sensitive highly-multiplexed single-cell RNA-Seq. Genome Biology. 17, 77 (2016).
- Natarajan, K. N. Single-cell tagged reverse transcription (STRT-Seq). Methods in Molecular Biology. 1979, 133-153 (2019).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Aldridge, S., Teichmann, S. A. Single cell transcriptomics comes of age. Nature Communications. 11, 4307 (2020).
- Clark, S. J., Lee, H. J., Smallwood, S. A., Kelsey, G., Reik, W. Single-cell epigenomics: Powerful new methods for understanding gene regulation and cell identity. Genome Biology. 17, 72 (2016).
- Christensson, E., Lewan, L. The use of spermidine for the isolation of nuclei from mouse liver. Studies of purity and yield during different physiological conditions. Zeitschrift für Naturforschung. Section C, Biosciences. 29 (5-6), 267-271 (1974).
- Levine, M. E., et al. Menopause accelerates biological aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (33), 9327-9332 (2016).
- Ossewaarde, M. E., et al. Age at menopause, cause-specific mortality and total life expectancy. Epidemiology. 16 (4), 556-562 (2005).
- Wellons, M., Ouyang, P., Schreiner, P. J., Herrington, D. M., Vaidya, D. Early menopause predicts future coronary heart disease and stroke: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Menopause. 19 (10), 1081-1087 (2012).
- Camaioni, A., et al. The process of ovarian aging: It is not just about oocytes and granulosa cells. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 39 (4), 783-792 (2022).
