Intra-peritoneal transplantation til generering af akut myeloid leukæmi hos mus
Summary
Her anvendes intraperitoneal injektion af leukæmiceller til at etablere og udbrede akut myeloid leukæmi (AML) hos mus. Denne nye metode er effektiv til serietransplantation af AML-celler og kan tjene som et alternativ for dem, der kan opleve vanskeligheder og uoverensstemmelser med intravenøs injektion hos mus.
Abstract
Der er et udækket behov for nye behandlinger til behandling af akut myeloid leukæmi (AML) og det tilhørende tilbagefald, der involverer stamceller fra vedvarende leukæmi (LSC’er). En eksperimentel AML-gnavermodel til test af terapier baseret på vellykket transplantation af disse celler via retro-orbitale injektioner i modtagermus er fyldt med udfordringer. Formålet med dette studie var at udvikle en nem, pålidelig og konsistent metode til at generere en robust murinmodel af AML ved hjælp af en intra-peritoneal vej. I denne protokol blev knoglemarvsceller transduceret med et retrovirus, der udtrykte humant MLL-AF9-fusionsoncoprotein. Effektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donor-LSC’er i udviklingen af primær AML blev testet, og intraperitoneal injektion blev vedtaget som en ny metode til at generere AML. Sammenligning mellem intra-peritoneale og retro-orbitale injektioner blev udført i serielle transplantationer for at sammenligne og kontrastere de to metoder. Både Lin– og LSK-celler transduceret med human MLL-AF9-virus indpodede godt i knoglemarven og milten hos modtagere, hvilket førte til en fuldblæst AML. Den intraperitoneale injektion af donorceller etablerede AML hos modtagere ved serietransplantation, og infiltrationen af AML-celler blev påvist i blod, knoglemarv, milt og lever hos modtagere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Således er intra-peritoneal injektion en effektiv metode til AML-induktion ved hjælp af seriel transplantation af donorleukæmiske celler.
Introduction
Akut myeloid leukæmi (AML) er en type hæmatologisk malignitet af forskellig ætiologi med dårlig prognose1. Genereringen af AML-dyremodeller lægger grundlaget for forståelsen af dens komplekse variationer og patobiologi i et forsøg på at opdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantation af donorceller, der udtrykker fusionsoncoproteiner, herunder fusioner, der involverer genet for blandet afstamning leukæmi (MLL) for kraftigt at inducere AML for at efterligne sygdommen hos mennesker3. Forskellige cellulære oprindelser af donorceller er blevet rapporteret i transplantationen af MLL-genassocieret AML4, hvor meget lidt er kendt om de celler, der er ansvarlige for sygdommens oprindelse.
Der er udviklet flere ruter til transplantation i mus; I stedet for en intra-femoral injektion, som direkte introducerer mutante donorceller i knoglemarv5, er en intravenøs injektion, der udnytter venøs sinusplexus, halevene og jugularvene, blevet brugt i vid udstrækning til at generere murin AML-modeller 6,7,8,9. I tilfælde af retroorbital injektion (r.o.) har forskellige iboende ulemper, såsom volumenbegrænsning, høj teknisk efterspørgsel, få chancer for gentagne forsøg eller fejl og potentielle øjenskader, været store anstødssten med begrænsede eller ingen levedygtige alternativer7. Haleveneinjektion kan have lignende problemer udover lokale skader; For at lette proceduren skal mus ofte opvarmes for at udvide deres haleårer10. Det er også svært at lokalisere halevenen uden en ekstra lyskilde, især i C57BL/6-stammen hos mus. Til jugular veneinjektion kræver forskningspersonale tilstrækkelig uddannelse til at lokalisere venen og begrænse mulige komplikationer. Derudover skal både venøse sinus- og jugularveneinjektioner udføres under anæstesi, hvilket tilføjer et andet niveau af kompleksitet. Det er derfor fristende at udforske nye veje til transplantation for at lette etableringen af AML-murinmodeller.
Intra-peritoneal (i.p.) injektion er almindeligt anvendt til at administrere lægemidler, farvestoffer og anæstetika 11,12,13,14,15; Det er også blevet brugt til at introducere hæmatopoietiske celler til ektopisk hæmatopoiesis16 og til at transplantere knoglemarvsafledte mesenkymale stamceller i forskellige musemodeller17,18,19,20,21. Det er dog sjældent blevet brugt til at etablere hæmatopoietiske maligniteter hos mus, især til at studere AML-sygdomsprogression.
Denne undersøgelse beskriver gennemførligheden af ip-injektion i genereringen af AML-musemodeller ud over at sammenligne transplantationseffektiviteten af afstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) populationer som donorceller. Disse resultater giver en enkel og effektiv måde at generere eksperimentelle modeller af AML og relaterede myeloide leukæmier. En sådan metode har potentiale til at fremme vores forståelse af sygdomsmekanismerne samt give en relativt nem model til at teste eksperimentelle terapier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disse ovenfor beskrevne undersøgelser giver understøttende bevis for, at transplantationen af Lin-celler er sammenlignelig med LSK-celler i dannelsen af 1° murine AML. Derudover viser de aktuelle data også, at ip-injektion er en effektiv og bekvem metode til at etablere murin AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injektion.
Ud over LSK-celler er andre populationer såsom granulocyt-monocytstamfader (GMP), almindelig lymfoid stamfader (CLP) og almindelig myeloid stamfader…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Huck Institute’s Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, Pennsylvania State University, for at yde rettidig teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA-projekt 4771, tiltrædelsesnummer 00000005 til KSP og RFP.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
