Burada, farelerde akut miyeloid lösemiyi (AML) oluşturmak ve yaymak için lösemi hücrelerinin intra-peritoneal enjeksiyonu kullanılır. Bu yeni yöntem, AML hücrelerinin seri transplantasyonunda etkilidir ve farelerde intravenöz enjeksiyon ile zorluk ve tutarsızlık yaşayabilecek kişiler için bir alternatif olarak hizmet edebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Farelerde akut miyeloid lösemi üretmek için intra-peritoneal transplantasyon
Bu makalede
Özet
Özet
Akut miyeloid lösemiyi (AML) ve kalıcı lösemi kök hücrelerini (LSC'ler) içeren ilişkili nüksleri tedavi etmek için yeni tedavilere karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Alıcı farelerde retro-orbital enjeksiyonlar yoluyla bu hücrelerin başarılı bir şekilde nakledilmesine dayanan terapileri test etmek için deneysel bir AML kemirgen modeli, zorluklarla doludur. Bu çalışmanın amacı, intraperitoneal bir yol kullanarak sağlam bir murin AML modeli oluşturmak için kolay, güvenilir ve tutarlı bir yöntem geliştirmektir. Mevcut protokolde, kemik iliği hücreleri, insan MLL-AF9 füzyon onkoproteinini eksprese eden bir retrovirüs ile dönüştürüldü. Primer AML gelişiminde donör LSC'ler olarak soy negatif (Lin-) ve Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) popülasyonlarının etkinliği test edilmiş ve AML üretmek için yeni bir yöntem olarak intra-peritoneal enjeksiyon benimsenmiştir. Seri transplantasyonlarda intraperitoneal ve retro-orbital enjeksiyonlar arasında karşılaştırma yapılarak iki yöntemin karşılaştırılması ve karşılaştırılması sağlandı. İnsan MLL-AF9 virüsü ile transdübe edilen hem Lin- hem de LSK hücreleri, alıcıların kemik iliğine ve dalağına iyi aşılanmış ve tam gelişmiş bir AML'ye yol açmıştır. Donör hücrelerin intraperitoneal enjeksiyonu, seri transplantasyon üzerine alıcılarda AML oluşturdu ve akım sitometrisi, qPCR ve histolojik analizlerle AML hücrelerinin infiltrasyonu alıcıların kan, kemik iliği, dalak ve karaciğerinde tespit edildi. Bu nedenle, intraperitoneal enjeksiyon, donör lösemik hücrelerin seri transplantasyonu kullanılarak AML indüksiyonunun etkili bir yöntemidir.
Giriş
Akut miyeloid lösemi (AML), kötü prognozlu1 etiyolojisi olan çeşitli hematolojik malignitelerin bir türüdür. AML hayvan modellerinin oluşturulması, yeni tedavileri keşfetme çabasıyla karmaşık varyasyonlarının ve patobiyolojisinin anlaşılması için temel oluşturur2. Farelerde lösemigenez, insanlarda hastalığı taklit etmek için AML'yi güçlü bir şekilde indüklemek için karışık soy lösemi (MLL) genini içeren füzyonlar da dahil olmak üzere füzyon onkoproteinlerini eksprese eden donör hücrelerin transplantasyonunu içerir3. MLL geni ile ilişkili AML4'ün transplantasyonunda donör hü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler, Pennsylvania Eyalet Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından önceden onaylanmıştır.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
- Ampisilin takviyeli (AP) LB agar plakaları (steril 10 cm plakalar) hazırlayın. Bunu yapmak için, 10 g LB suyunu agar ile 400 mL damıtılmış suda çözün, karıştırın ve hacmi 500 mL'ye çıkarın. Çözeltiyi otoklavlayarak sterilize edin, ardından çözeltinin soğumasını bekleyin, çözeltiye 0,5 mL ampisilin (stok: 150 mg / mL) ekleyin ve karıştırmak için çalkalayın. Hemen bir alkol lambasının yakınındaki steril 10 cm'lik bir plakaya 18 mL çözelti ekle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Murin AML hücrelerinin transplantasyon etkinliğinin r.o. ve i.p. transplantasyon yolları kullanılarak karşılaştırılması
Daha önce, MLL-AF9-transdüse LSK hücreleri ile retro-orbital olarak nakledilen alıcı farelerde 1° AML oluşumu bildirilmiş ve 1° AML hücrelerinin nakledilebilirliği seri transplantasyon30 ile gösterilmiştir. Bu çalışma, transplantasyon gerçekleştirmek için kemik iliği Lin-hücrelerinin kullanılma olasılığını değerlendiren ilk çalışmadır. Anormal lökos.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda tarif edilen bu çalışmalar, Lin- hücrelerinin transplantasyonunun 1 ° murin AML oluşumundaki LSK hücreleri ile karşılaştırılabilir olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır. Ek olarak, mevcut veriler ayrıca i.p. enjeksiyonunun, intravenöz (veya ro) enjeksiyona kıyasla murin AML'yi oluşturmak için etkili ve uygun bir yöntem olduğunu göstermektedir.
LSK hücrelerine ek olarak, granülosit-monosit progenitör (GMP), ortak lenfoid progenitör (CLP) ve ortak miyeloid progenitö.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, Huck Enstitüsü'nün Akış Sitometri Çekirdek Tesisi'ne ve Pennsylvania Eyalet Üniversitesi, Veterinerlik ve Biyomedikal Bilimler Bölümü, Hayvan Teşhis Laboratuvarı'nın Histopatoloji Çekirdek Tesisi'ne zamanında teknik destek sağladıkları için teşekkür eder. Bu çalışma, Amerikan Kanser Araştırmaları Enstitüsü (KSP), Penn State Tarım Bilimleri Koleji, Penn State Kanser Enstitüsü, USDA-NIFA projesi 4771, K.S.P. ve R.F.P.'ye 00000005 katılım numarası ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| a-Yetkili hücreleri seçin | Bioline | BIO-85027 | |
| Amonyum klorür (NH4< / sub>Cl) | Sigma Aldrich | Cat # A-9434 | |
| Ampisilin | Sigma Aldrich Cat | # A0797 | |
| Sığır Serum Albümini (BSA), Fraksiyon V & mdash; Düşük Endotoksin Sınıfı | İkizler biyo-ürünleri | Kedi # 700-102P | |
| Siprofloksasin HCl | GoldBio.com | Kedi # C-861-100 | |
| DMEM, yüksek glikoz, glutamin yok | Gibco | Kedi # 11960-044 | |
| Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) | Corning | Cat # 21-031-CV | |
| EDTA, Disodyum Tuzu (EDTA-2Na), Dihidrat, Moleküler Biyoloji Sınıfı | Calbiochem | Cat # 324503 | |
| Fetal Sığır Serumu - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat # S11550 | |
| Holo-transferrin, sığır | Sigma Aldrich | Cat # T1283 | |
| İnsülin çözeltisi insan | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamin 200 mM (100&kez;) çözümü | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB et suyu, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| Agarlı LB Suyu (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Fare anti-fare CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Kedi # 130-124-211 | |
| Fare İnterlökin-3 (IL-3) | İkizler biyo-ürünleri | Kedi # 300-324P | |
| Fare İnterlökin-6 (IL-6) | İkizler biyo-ürünleri | Kedi # 300-327P | |
| Fare Kök Hücre Faktörü (SCF) | İkizler biyo-ürünleri | Kedi # 300-348P | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phoenix-Eco (pECO) hücreleri | ATCC | CRL-3214 | |
| Potasyum Bikarbonat (KHCO3), Granül | JT. Fırıncı | Kedi # 2940-01 | |
| Sıçan anti-fare CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Kedi # 105812 | |
| Sıçan anti-fare Ly-6A / E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Kedi # 558162 | |
| Rekombinant Murin Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Kedi # 250-31L | |
| RetroNectin Rekombinant İnsan Fibronektin Fragmanı | TaKaRa | Cat # T100A | |
| Trans< / em > IT-293 Reaktif | MirusBio | Cat # MIR 2705 | |
| TRI Reaktif | Sigma Aldrich | Cat # T9424 | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi,% 0.4 | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısı | Gibco | Cat # 25200-056 | |
| & beta ; -Merkaptoetanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat # M3148 | |
| < güçlü> Ticari Tahliller | |||
| EasySep Fare Hematopoietik Progenitör Hücre İzolasyon Kiti | Kök Hücre teknolojileri | Cat# 19856A | |
| Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti | Termo Balıkçı | Kedi # 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Kedi # 95051-500 | |
| Plazmid Maxi Kiti (25) | Qiagen | Kedi #: 12163 | |
| < güçlü > Hayvanlar < / güçlü > | |||
| >< Ai14 < sup> TdTomato< > < / em > Fareler | Jackson Laboratuvar | Suşu # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6 / J fareler ve nbsp; | Jackson Laboratuvar | Suşu # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6 / J fareler | Jackson Laboratuvar | Zorlanması # 000664 | |
| Aletler ve Yazılımlar | |||
| Adobe illustrator | Sürüm 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 akış sitometresi | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys yazılım programı | Sürüm 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism sürüm 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Gerçek zamanlı PCR sistemi | Uygulamalı Biyosistemler | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Kemilüminesans Floresan Görüntüleme | G:Box Chemi |
Kaynaklar
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
