השתלה תוך צפקית ליצירת לוקמיה מיאלואידית חריפה בעכברים
Summary
כאן, הזרקה תוך פריטוניאלית של תאי לוקמיה מנוצלת כדי לבסס ולהפיץ לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) בעכברים. שיטה חדשה זו יעילה בהשתלה סדרתית של תאי AML ויכולה לשמש חלופה למי שעלול לחוות קשיים וחוסר עקביות עם הזרקה תוך ורידית בעכברים.
Abstract
קיים צורך בלתי מסופק בטיפולים חדשניים לטיפול בלוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) והישנות הנלווית הכוללת תאי גזע לוקמיה מתמשכת (LSCs). מודל ניסיוני של מכרסמים AML לבדיקת טיפולים המבוססים על השתלה מוצלחת של תאים אלה באמצעות זריקות רטרו-מסלוליות בעכברים מושתלים טומן בחובו אתגרים. מטרת מחקר זה הייתה לפתח שיטה קלה, אמינה ועקבית ליצירת מודל מורין חזק של AML באמצעות מסלול תוך פריטוניאלי. בפרוטוקול הנוכחי, תאי מח עצם הומרו עם רטרו-וירוס המבטא אונקופרוטאין היתוך MLL-AF9 אנושי. נבדקה יעילותן של אוכלוסיות שליליות בשושלת (Lin-) ו- Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) כ– LSCs תורמים בפיתוח AML ראשוני, והזרקה תוך צפקית אומצה כשיטה חדשה ליצירת AML. השוואה בין זריקות תוך פריטוניאליות ורטרו-אורביטליות נעשתה בהשתלות סדרתיות כדי להשוות ולהשוות בין שתי השיטות. תאי לין ו-LSK שהותמרו עם נגיף MLL-AF9 אנושי הושתלו היטב במח העצם ובטחול של המושתלים, מה שהוביל ל-AML במלוא מובן המילה. הזרקה תוך-צפקית של תאי תורם ביססה AML במושתלים לאחר השתלה סדרתית, וחדירת תאי AML זוהתה בדם, במח העצם, בטחול ובכבד של המושתלים על ידי ציטומטריית זרימה, qPCR וניתוחים היסטולוגיים. לפיכך, הזרקה תוך צפקית היא שיטה יעילה להשראת AML באמצעות השתלה סדרתית של תאים לוקמיים מתורם.
Introduction
לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) היא סוג של ממאירות המטולוגית של אטיולוגיה מגוונת עם פרוגנוזה גרועה1. דור המודלים של AML בבעלי חיים מניח את היסודות להבנת הווריאציות המורכבות והפתולוגיה שלו במאמץ לגלות טיפולים חדשניים2. לוקמוגנזה בעכברים כוללת השתלה של תאי תורם המבטאים אונקופרוטאינים היתוך, כולל איחוי המערב את הגן לוקמיה שושלת מעורבת (MLL) כדי לגרום ל- AML בעוצמה, כדי לחקות את המחלה בבני אדם3. מקורות תאיים שונים של תאי תורם דווחו בהשתלת AML4 הקשור לגן MLL, כאשר מעט מאוד ידוע על התאים האחראים למקור המחלה.
פותחו מסלולים רבים להשתלה בעכברים; במקום זריקה תוך-פמורלית, המחדירה ישירות תאי תורם מוטנטיים למח עצם5, נעשה שימוש נרחב בזריקה תוך-ורידית המשתמשת במקלעת הסינוסים הוורידית, וריד הזנב ווריד הצוואר ליצירת מודלים 6,7,8,9 של AML. במקרה של הזרקת רטרו-אורביטל (r.o.), חסרונות מובנים שונים, כגון הגבלת נפח, ביקוש טכני גבוה, סיכויים מעטים לניסיונות חוזרים או טעויות, ופגיעות עיניים פוטנציאליות, היו אבני נגף עיקריות עם חלופות מוגבלות או ללא קיימות7. הזרקת ורידים זנב יכולה להיות בעיות דומות מלבד פציעות מקומיות; כדי להקל על ההליך, עכברים לעתים קרובות צריך להיות מחומם כדי להרחיב את ורידי הזנב שלהם10. כמו כן, קשה לאתר את וריד הזנב ללא מקור אור נוסף, במיוחד בזן C57BL/6 של עכברים. עבור הזרקת ורידים Jugular, אנשי המחקר דורשים הכשרה מספקת כדי לאתר את הווריד ולהגביל סיבוכים אפשריים. בנוסף, הן סינוס ורידי זריקות ורידים jugular צריך להתבצע תחת הרדמה, אשר מוסיף רמה נוספת של מורכבות. לכן, מפתה לחקור מסלולים חדשים להשתלה כדי להקל על הקמת מודלים של AML murine.
הזרקה תוך צפקית (i.p.) משמשת בדרך כלל למתן תרופות, צבעים והרדמה 11,12,13,14,15; הוא שימש גם להחדרת תאים המטופויטיים להמטופויזיס חוץ רחמי16 ולהשתלת תאי גזע מזנכימליים שמקורם במח עצם במודלים שונים של עכברים 17,18,19,20,21. עם זאת, הוא שימש לעתים רחוקות כדי לבסס ממאירויות hematopoietic בעכברים, במיוחד כדי לחקור את התקדמות מחלת AML.
המחקר הנוכחי מתאר את ההיתכנות של הזרקת i.p. בדור של מודלים של עכברי AML, בנוסף להשוואת יעילות ההשתלה של אוכלוסיות שליליות בשושלת (Lin-) ו- Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) כתאי תורם. ממצאים אלה מספקים דרך פשוטה ויעילה ליצור מודלים ניסיוניים של AML ולוקמיה מיאלואידית קשורה. לשיטה כזו יש פוטנציאל לקדם את הבנתנו את מנגנוני המחלה, כמו גם לספק מודל קל יחסית לבדיקת טיפולים ניסיוניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים אלה המתוארים לעיל מספקים ראיות תומכות לכך שהשתלת תאי לין דומה לתאי LSK בדור של AML מורין 1°. בנוסף, הנתונים הנוכחיים מראים גם כי הזרקת I.P. היא שיטה יעילה ונוחה לביסוס AML מורין בהשוואה להזרקה תוך ורידית (או r.o.).
בנוסף לתאי LSK, אוכלוסיות אחרות כגון אב גרנולוציטים-מונוציט…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למתקן הליבה של ציטומטריית זרימה של מכון האק ולמתקן הליבה להיסטופתולוגיה של המעבדה לאבחון בעלי חיים, המחלקה למדעי הווטרינריה והביו-רפואה, אוניברסיטת פנסילבניה, על מתן תמיכה טכנית בזמן. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון האמריקאי לחקר הסרטן (KSP), מכללת פן סטייט למדעי החקלאות, מכון הסרטן פן סטייט, פרויקט USDA-NIFA 4771, הצטרפות מספר 00000005 ל- K.S.P. ו- R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
