생쥐에서 급성 골수성 백혈병을 발생시키기 위한 복강내 이식
Summary
여기서, 백혈병 세포의 복강 내 주사는 마우스에서 급성 골수성 백혈병(AML)을 확립하고 전파하는 데 활용됩니다. 이 새로운 방법은 AML 세포의 연속 이식에 효과적이며 생쥐에서 정맥 주사에 어려움과 불일치를 경험할 수 있는 사람들을 위한 대안이 될 수 있습니다.
Abstract
급성 골수성 백혈병(AML) 및 지속성 백혈병 줄기 세포(LSC)와 관련된 관련 재발을 치료하기 위한 새로운 치료법에 대한 미충족 수요가 있습니다. 수용자 마우스에 역궤도 주사를 통해 이러한 세포를 성공적으로 이식하는 것을 기반으로 하는 치료법을 테스트하기 위한 실험적 AML 설치류 모델은 도전 과제로 가득 차 있습니다. 이 연구의 목적은 복강 내 경로를 사용하여 AML의 강력한 쥐 모델을 생성하는 쉽고 신뢰할 수 있으며 일관된 방법을 개발하는 것이었습니다. 본 프로토콜에서, 골수 세포는 인간 MLL-AF9 융합 종양 단백질을 발현하는 레트로바이러스로 형질도입되었다. 원발성 AML의 발달에서 기증자 LSC로서 계통 음성(Lin-) 및 Lin-Sca-1+c-Kit+(LSK) 집단의 효율성을 테스트하고 AML을 생성하는 새로운 방법으로 복강내 주사를 채택했습니다. 복강내 주사와 안와후부 주사의 비교는 두 가지 방법을 비교하고 대조하기 위해 연속 이식에서 수행되었습니다. 인간 MLL-AF9 바이러스로 형질도입된 Lin– 및 LSK 세포는 모두 수용자의 골수와 비장에 잘 생착되어 완전한 AML로 이어집니다. 연속 이식 시 공여자 세포의 복강 내 주사로 수혜자에게 AML이 형성되었고, 유세포 분석, qPCR 및 조직학적 분석을 통해 수혜자의 혈액, 골수, 비장 및 간에서 AML 세포의 침윤이 검출되었습니다. 따라서, 복강내 주사는 기증자 백혈병 세포의 연속 이식을 이용한 AML 유도의 효율적인 방법이다.
Introduction
급성 골수성 백혈병(AML)은 예후가 좋지 않은 다양한 병인의 혈액학적 악성 종양의 일종이다1. AML 동물 모델의 생성은 새로운 치료법을 발견하기 위한 노력의 일환으로 복잡한 변이와 병리학을 이해하기 위한 토대를 마련한다2. 생쥐의 백혈구 생성은 혼합 혈통 백혈병(mixed lineage leukemia, MLL) 유전자를 포함하는 융합체를 포함하여 융합 종양 단백질을 발현하는 공여 세포를 이식하여 AML을 강력하게 유도하여 인간의 질병을 모방하는 것을 포함한다3. MLL 유전자 관련 AML4의 이식에서 공여자 세포의 다양한 세포 기원이 보고되었으며, 질병 기원을 담당하는 세포에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다.
생쥐 이식을 위해 여러 경로가 개발되었습니다. 돌연변이 공여 세포를골수 내로 직접 도입하는 대퇴골 내 주사 5 대신, 정맥동 신경총, 꼬리 정맥 및 경정맥을 이용하는 정맥 주사가 쥐 AML 모델 6,7,8,9을 생성하는데 널리 사용되어 왔다. retro-orbital (r.o.) 주사의 경우, 부피 제한, 높은 기술적 요구, 반복적인 시도 또는 오류의 가능성 적음, 잠재적인 안구 손상과 같은 다양한 내재적 단점이 제한적이거나 실행 가능한 대안이 없는 주요 걸림돌이 되었습니다7. 꼬리 정맥 주사는 국소 부상 외에도 유사한 문제를 가질 수 있습니다. 시술을 용이하게 하기 위해, 생쥐는 종종 꼬리 정맥을 확장시키기 위해 워밍업을 할 필요가 있다10. 또한 추가 광원 없이는 꼬리 정맥을 찾기가 어려우며, 특히 C57BL/6 균주의 마우스에서 그렇습니다. 경정맥 주사의 경우 연구 인력은 정맥을 찾고 가능한 합병증을 제한하기 위해 충분한 교육이 필요합니다. 또한 정맥동과 경정맥 주사는 모두 마취하에 수행해야하므로 또 다른 수준의 복잡성이 추가됩니다. 따라서 AML 쥐 모델의 확립을 촉진하기 위해 이식을 위한 새로운 경로를 탐색하고 싶은 유혹이 있습니다.
복강내(i.p.) 주사는 일반적으로 약물, 염료 및 마취제를 투여하는 데 사용된다 11,12,13,14,15; 또한 이소성 조혈을 위한 조혈 세포를 도입하고(16) 다양한 마우스 모델(17,18,19,20,21)에서 골수 유래 중간엽 줄기 세포를 이식하는 데 사용되어 왔다. 그러나 마우스에서 조혈 악성 종양을 확립하는 데 자주 사용되지 않았으며, 특히 AML 질병 진행을 연구하는 데 사용되지 않았습니다.
본 연구는 기증자 세포로서 계통 음성(Lin-) 및 Lin-Sca-1+c-Kit+(LSK) 집단의 이식 효율을 비교하는 것 외에도 AML 마우스 모델 생성에서 IP 주입의 타당성을 설명합니다. 이러한 발견은 AML 및 관련 골수성 백혈병의 실험 모델을 생성하는 간단하고 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 방법은 질병 메커니즘에 대한 이해를 넓힐 뿐만 아니라 실험적 치료법을 테스트하기 위한 비교적 쉬운 모델을 제공할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 상술한 연구들은 Lin– 세포의 이식이 1° 쥐 AML의 생성에서 LSK 세포와 비슷하다는 것을 뒷받침하는 증거를 제공한다. 또한, 현재 데이터는 i.p. 주사는 정맥 주사(또는 r.o.) 주사에 비해 쥐 AML을 확립하는 효율적이고 편리한 방법입니다.
LSK 세포 외에도 과립구-단핵구 전구체(GMP), 일반 림프구 전구체(CLP) 및 일반 골수 전구체(CMP)와 같은 다른 집단이 다양한 배양 기?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 적시에 기술 지원을 제공한 Huck Institute의 유세포 분석 핵심 시설과 펜실베니아 주립 대학의 수의학 및 의생명과학부 동물 진단 실험실의 조직병리학 핵심 시설에 감사드립니다. 이 연구는 미국 암 연구소 (KSP), 펜실베니아 주립 농업 과학 대학, 펜실베니아 주립 암 연구소, USDA-NIFA 프로젝트 4771, KSP 및 RFP에 대한 수탁 번호 00000005의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
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