Transplantation intrapéritonéale pour générer une leucémie myéloïde aiguë chez la souris
Summary
Ici, l’injection intrapéritonéale de cellules leucémiques est utilisée pour établir et propager la leucémie myéloïde aiguë (LAM) chez la souris. Cette nouvelle méthode est efficace dans la transplantation en série de cellules AML et peut servir d’alternative pour ceux qui peuvent éprouver des difficultés et des incohérences avec l’injection intraveineuse chez la souris.
Abstract
Il existe un besoin non satisfait de nouvelles thérapies pour traiter la leucémie myéloïde aiguë (LAM) et la rechute associée qui implique des cellules souches leucémiques persistantes (LSC). Un modèle expérimental de rongeurs AML pour tester des thérapies basées sur la transplantation réussie de ces cellules par injections rétro-orbitales chez des souris receveuses est semé d’embûches. L’objectif de cette étude était de développer une méthode simple, fiable et cohérente pour générer un modèle murin robuste de LAM en utilisant une voie intrapéritonéale. Dans le protocole actuel, les cellules de la moelle osseuse ont été transduites avec un rétrovirus exprimant l’oncoprotéine de fusion MLL-AF9 humaine. L’efficacité des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que CLL donneurs dans le développement de la LAM primaire a été testée, et l’injection intrapéritonéale a été adoptée comme nouvelle méthode pour générer la LAM. La comparaison entre les injections intra-péritonéales et rétro-orbitales a été faite dans des transplantations en série pour comparer et contraster les deux méthodes. Les cellules Lin- et LSK transduites avec le virus MLL-AF9 humain bien greffé dans la moelle osseuse et la rate des receveurs, conduisant à une LAM à part entière. L’injection intrapéritonéale de cellules de donneur a établi la LAM chez les receveurs lors de la transplantation en série, et l’infiltration de cellules de LAM a été détectée dans le sang, la moelle osseuse, la rate et le foie des receveurs par cytométrie en flux, qPCR et analyses histologiques. Ainsi, l’injection intrapéritonéale est une méthode efficace d’induction de la LAM utilisant la transplantation en série de cellules leucémiques de donneur.
Introduction
La leucémie myéloïde aiguë (LAM) est un type d’hémopathie maligne d’étiologie diverse avec un mauvais pronostic1. La génération de modèles animaux de LAM jette les bases de la compréhension de ses variations complexes et de sa pathobiologie dans le but de découvrir de nouvelles thérapies2. La leucémogenèse chez la souris implique la transplantation de cellules de donneurs exprimant des oncoprotéines de fusion, y compris des fusions impliquant le gène de la leucémie de lignée mixte (MLL) pour induire puissamment la LAM, afin d’imiter la maladie chez l’homme3. Diverses origines cellulaires de cellules de donneurs ont été rapportées lors de la transplantation de LAM4 associée au gène LAM, et on sait très peu de choses sur les cellules responsables de l’origine de la maladie.
Plusieurs voies ont été développées pour la transplantation chez la souris; plutôt qu’une injection intra-fémorale, qui introduit directement des cellules donneuses mutantes dans la moelle osseuse5, une injection intraveineuse qui utilise le plexus du sinus veineux, la veine de la queue et la veine jugulaire a été largement utilisée pour générer des modèles murins de LAM 6,7,8,9. Dans le cas de l’injection rétro-orbitale (r.o.), divers inconvénients inhérents, tels que la limitation du volume, la forte demande technique, le peu de risques de tentatives répétées ou d’erreurs, et les lésions oculaires potentielles, ont été des pierres d’achoppement majeures avec peu ou pas d’alternatives viables7. L’injection de veines de queue peut avoir des problèmes similaires en plus des blessures locales; Pour faciliter la procédure, les souris ont souvent besoin d’être réchauffées pour dilater leurs veines de la queue10. Il est également difficile de localiser la veine de la queue sans source de lumière supplémentaire, en particulier chez la souche C57BL / 6 de souris. Pour l’injection de la veine jugulaire, le personnel de recherche a besoin d’une formation suffisante pour localiser la veine et limiter les complications possibles. De plus, les injections du sinus veineux et de la veine jugulaire doivent être effectuées sous anesthésie, ce qui ajoute un autre niveau de complexité. Ainsi, il est tentant d’explorer de nouvelles voies de transplantation pour faciliter l’établissement de modèles murins de LMA.
L’injection intrapéritonéale (i.p.) est couramment utilisée pour administrer des médicaments, des colorants et des anesthésiques 11,12,13,14,15; Il a également été utilisé pour introduire des cellules hématopoïétiques pour l’hématopoïèse ectopique16 et pour transplanter des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse dans divers modèles murins 17,18,19,20,21. Cependant, il a été rarement utilisé pour établir des tumeurs malignes hématopoïétiques chez la souris, en particulier pour étudier la progression de la LMA.
La présente étude décrit la faisabilité de l’injection intraveineuse dans la génération de modèles murins AML, en plus de comparer l’efficacité de transplantation des populations de lignées négatives (Lin-) et Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) en tant que cellules donneuses. Ces résultats fournissent un moyen simple et efficace de générer des modèles expérimentaux de LAM et de leucémies myéloïdes connexes. Une telle méthode a le potentiel d’approfondir notre compréhension des mécanismes de la maladie et de fournir un modèle relativement facile pour tester des thérapies expérimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ces études décrites ci-dessus fournissent des preuves à l’appui que la transplantation de cellules Lin– est comparable à celle de cellules LSK dans la génération de LAM murine de 1°. En outre, les données actuelles montrent également que l’injection intraveineuse est une méthode efficace et pratique pour établir la LAM murine par rapport à l’injection intraveineuse (ou r.o.).
En plus des cellules LSK, d’autres populations telles que le progéniteur granulocytaire…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient le Flow Cytometry Core Facility du Huck Institute et l’Histopathology Core Facility du Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, pour leur soutien technique en temps opportun. Ce travail a été soutenu par des subventions de l’American Institute for Cancer Research (KSP), du Penn State College of Agricultural Sciences, du Penn State Cancer Institute, du projet USDA-NIFA 4771, numéro d’acquisition 00000005 à K.S.P. et R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
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