マウスにおける急性骨髄性白血病発症のための腹腔内移植
Summary
ここでは、白血病細胞の腹腔内注射を利用して、マウスの急性骨髄性白血病(AML)を確立し、増殖させます。この新しい方法は、AML細胞の連続移植に効果的であり、マウスへの静脈内注射で困難や矛盾を経験する可能性のある人の代替手段として役立ちます。
Abstract
急性骨髄性白血病(AML)および持続性白血病幹細胞(LSC)を含む関連する再発を治療するための新しい治療法の満たされていないニーズがあります。レシピエントマウスへの眼窩後注射によるこれらの細胞の移植の成功に基づく治療法をテストするための実験的なAMLげっ歯類モデルは、課題に満ちています。この研究の目的は、腹腔内経路を使用してAMLの堅牢なマウスモデルを生成するための簡単で信頼性が高く、一貫した方法を開発することでした。本プロトコールでは、骨髄細胞を、ヒトMLL−AF9融合癌タンパク質を発現するレトロウイルスで形質導入した。原発性AMLの発症におけるドナーLSCとしての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の効率が検証され、AMLを生成する新しい方法として腹腔内注射が採用されました。腹腔内注射と眼窩後注射の比較は、2つの方法を比較対照するために連続移植で行われました。ヒトMLL-AF9ウイルスで形質導入されたLin細胞とLSK細胞の両方が、レシピエントの骨髄と脾臓によく生着し、本格的なAMLを引き起こしました。ドナー細胞の腹腔内注射は、連続移植時にレシピエントにAMLを確立し、AML細胞の浸潤は、フローサイトメトリー、qPCR、および組織学的分析によってレシピエントの血液、骨髄、脾臓、および肝臓で検出されました。したがって、腹腔内注射は、ドナー白血病細胞の連続移植を用いたAML誘導の効率的な方法です。
Introduction
急性骨髄性白血病(AML)は、予後不良の多様な病因の血液悪性腫瘍の一種です1。AML動物モデルの生成は、その複雑な変異と病理生物学を理解するための基礎を築き、新しい治療法を発見します2。マウスの白血病発生は、AMLを強力に誘導する混合系統白血病(MLL)遺伝子を含む融合癌タンパク質を発現するドナー細胞を移植して、ヒトの疾患を模倣することを含みます3。MLL遺伝子関連AML4の移植では、ドナー細胞の様々な細胞起源が報告されており、疾患起源の原因となる細胞についてはほとんど知られていない。
マウスへの移植のために複数の経路が開発されている。変異ドナー細胞を骨髄5に直接導入する大腿骨内注射ではなく、静脈副鼻腔神経叢、尾静脈、頸静脈を利用する静脈内注射がマウスAMLモデル6、7、8、9の作製に広く用いられている。眼窩後方(r.o.)注射の場合、体積制限、高い技術的要求、繰り返しの試行またはエラーの可能性の少なさ、潜在的な眼の損傷など、さまざまな固有の欠点が大きな障害であり、実行可能な代替手段が限られているか、まったくありません7。尾静脈注射は、局所的な怪我以外にも同様の問題を引き起こす可能性があります。手順を容易にするために、マウスはしばしば尾静脈を拡張するためにウォームアップする必要があります10。また、特にC57BL/6系統のマウスでは、追加の光源なしで尾静脈を見つけることは困難です。頸静脈注射の場合、研究担当者は静脈を特定し、起こりうる合併症を制限するために十分なトレーニングを必要とします。さらに、静脈洞と頸静脈の両方の注射を麻酔下で行う必要があり、これは別のレベルの複雑さを追加します。したがって、AMLマウスモデルの確立を促進するために、移植の新しいルートを模索するのは魅力的です。
腹腔内(i.p.)注射は、薬物、染料、および麻酔薬の投与に一般的に使用されます11、12、13、14、15;また、異所性造血のための造血細胞の導入16や、骨髄由来間葉系幹細胞の移植にも使用されています17、18、19、20、21。しかし、マウスの造血器悪性腫瘍の確立、特にAML疾患の進行を研究するためにめったに使用されていません。
本研究では、ドナー細胞としての系統陰性(Lin-)およびLin-Sca-1+c-Kit+(LSK)集団の移植効率を比較することに加えて、AMLマウスモデルの生成におけるi.p.注射の実現可能性について説明します。これらの知見は、AMLおよび関連する骨髄性白血病の実験モデルを簡単かつ効率的に生成する方法を提供する。このような方法は、疾患メカニズムの理解を深めるだけでなく、実験的治療法をテストするための比較的簡単なモデルを提供する可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
これらの上記の研究は、Lin細胞の 移植が1°マウスAMLの生成においてLSK細胞に匹敵するという支持的な証拠を提供します。さらに、現在のデータは、i.p.注射が静脈内(またはr.o.)注射と比較してマウスAMLを確立するための効率的で便利な方法であることも示しています。
LSK細胞に加えて、顆粒球単球前駆細胞(GMP)、共通リンパ系前駆細胞(CLP)、および共通骨髄系前駆…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ペンシルベニア州立大学獣医生物医科学部動物診断研究所のハック研究所のフローサイトメトリーコアファシリティと組織病理学コアファシリティがタイムリーな技術サポートを提供してくれたことに感謝します。この研究は、米国がん研究所(KSP)、ペンシルベニア州立農業科学大学、ペンシルベニア州立がん研究所、USDA-NIFAプロジェクト4771、K.S.P.およびRFPへのアクセッション番号00000005からの助成金によってサポートされました。
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
References
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
