Her brukes intraperitoneal injeksjon av leukemiceller for å etablere og forplante akutt myelogen leukemi (AML) hos mus. Denne nye metoden er effektiv i seriell transplantasjon av AML-celler og kan tjene som et alternativ for de som kan oppleve vanskeligheter og inkonsekvenser med intravenøs injeksjon hos mus.
Det er et udekket behov for nye terapier for å behandle akutt myelogen leukemi (AML) og tilhørende tilbakefall som involverer vedvarende leukemi stamceller (LSCs). En eksperimentell AML-gnagermodell for å teste terapier basert på vellykket transplantasjon av disse cellene via retro-orbitale injeksjoner hos mottakermus er full av utfordringer. Målet med denne studien var å utvikle en enkel, pålitelig og konsistent metode for å generere en robust murine modell av AML ved hjelp av en intraperitoneal rute. I denne protokollen ble benmargsceller transdusert med et retrovirus som uttrykker humant MLL-AF9-fusjonsonkoprotein. Effektiviteten av populasjoner av lineage negative (Lin-) og Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) som donor-LSC i utviklingen av primær AML ble testet, og intraperitoneal injeksjon ble tatt i bruk som en ny metode for å generere AML. Sammenligning mellom intraperitoneale og retroorbitale injeksjoner ble gjort i serietransplantasjoner for å sammenligne og kontrastere de to metodene. Både Lin– og LSK-celler transducert med humant MLL-AF9-virus innpodet godt i benmarg og milt hos mottakere, noe som førte til en fullblåst AML. Intraperitoneal injeksjon av donorceller etablerte AML hos mottakere ved serietransplantasjon, og infiltrasjon av AML-celler ble påvist i blod, benmarg, milt og lever hos mottakere ved flowcytometri, qPCR og histologiske analyser. Dermed er intraperitoneal injeksjon en effektiv metode for AML-induksjon ved bruk av seriell transplantasjon av donor leukemiske celler.
Akutt myelogen leukemi (AML) er en type hematologisk malignitet av ulik etiologi med dårlig prognose1. Genereringen av AML-dyremodeller legger grunnlaget for forståelsen av dens komplekse variasjoner og patobiologi i et forsøk på å oppdage nye terapier2. Leukemogenese hos mus involverer transplantasjon av donorceller som uttrykker fusjonsonkoproteiner, inkludert fusjoner som involverer genet blandet avstamningsleukemi (MLL) for å indusere AML, for å etterligne sykdommen hos mennesker3. Ulike cellulære opprinnelser av donorceller har blitt rapportert ved transplantasjon av MLL-genassosiert AML4, med svært lite kjent om cellene som er ansvarlige for sykdommens opprinnelse.
Flere ruter er utviklet for transplantasjon hos mus; I stedet for en intrafemoral injeksjon, som direkte introduserer mutante donorceller i benmarg5, har en intravenøs injeksjon som benytter venøs sinus plexus, hale vene og jugularvenen blitt mye brukt til å generere murine AML-modeller 6,7,8,9. Når det gjelder retro-orbital (r.o.) injeksjon, har ulike iboende ulemper, som volumbegrensning, høy teknisk etterspørsel, få sjanser for gjentatte forsøk eller feil, og potensielle okulære skader, vært store snublesteiner med begrensede eller ingen levedyktige alternativer7. Tail vein injeksjon kan ha lignende problemer i tillegg til lokale skader; For å lette prosedyren, må mus ofte varmes opp for å utvide haleårene10. Det er også vanskelig å lokalisere halevenen uten en ekstra lyskilde, spesielt i C57BL/6-stammen til mus. For jugularveneinjeksjon krever forskningspersonell tilstrekkelig trening for å lokalisere venen og begrense mulige komplikasjoner. I tillegg må både venøs sinus og jugularveninjeksjoner utføres under anestesi, noe som legger til et annet nivå av kompleksitet. Det er derfor fristende å utforske nye transplantasjonsveier for å lette etableringen av AML-murinmodeller.
Intraperitoneal (i.p.) injeksjon brukes ofte til å administrere medisiner, fargestoffer og anestetika 11,12,13,14,15; Det har også blitt brukt til å introdusere hematopoietiske celler for ektopisk hematopoiesis16 og å transplantere benmargsavledede mesenkymale stamceller i forskjellige musemodeller 17,18,19,20,21. Det har imidlertid blitt sjelden brukt til å etablere hematopoietiske maligniteter hos mus, spesielt for å studere AML sykdomsprogresjon.
Denne studien beskriver gjennomførbarheten av i.p. injeksjon i genereringen av AML-musemodeller, i tillegg til å sammenligne transplantasjonseffektiviteten av avstamningsnegative (Lin-) og Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK) populasjoner som donorceller. Disse funnene gir en enkel og effektiv måte å generere eksperimentelle modeller av AML og relaterte myelogen leukemier. En slik metode har potensial til å fremme vår forståelse av sykdomsmekanismene, samt gi en relativt enkel modell for å teste eksperimentelle terapier.
Disse ovenfor beskrevne studiene gir støttende bevis på at transplantasjon av Lin-celler er sammenlignbar med LSK-celler i genereringen av 1° murine AML. I tillegg viser de nåværende dataene også at i.p. injeksjon er en effektiv og praktisk metode for å etablere murine AML sammenlignet med intravenøs (eller r.o.) injeksjon.
I tillegg til LSK-celler har andre populasjoner som granulocytt-monocytt-stamfar (GMP), vanlig lymfoid stamfar (CLP) og vanlig myeloid stamfar (CMP) blit…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Huck Institute’s Flow Cytometry Core Facility og Histopathology Core Facility of the Animal Diagnostic Laboratory, Department of Veterinary and Biomedical Sciences, The Pennsylvania State University, for å gi rettidig teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA prosjekt 4771, tiltredelsesnummer 00000005 til KSP og RFP
a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
Commercial Assays | |||
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
Animals | |||
Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
Instruments and Softwares | |||
Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
FlowJo 10.8.0 | BD | ||
GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |