枯草芽孢杆菌孢子计数和标记分析在流式细胞术中的改进
Summary
该协议侧重于使用流式细胞术和计数珠来定量用溴化乙锭标记的细菌孢子。该方法还可用于分析完整孢子表面蛋白质的共价偶联。
Abstract
枯草芽孢杆菌的孢子已被提议用于不同的生物技术和免疫学应用;然而，越来越需要开发改进固定在孢子表面的抗原及其定量的方法。基于流式细胞术的分析以前已被提出作为检测枯草芽孢杆菌标记细胞的快速、可靠和特异性方法。在此，我们建议使用流式细胞术来评估荧光抗体（FA）在孢子表面的显示效率，并使用计数珠量化孢子的数量。
为此，我们使用溴化乙锭作为 DNA 标记物，并使用与孢子偶联的别藻蓝蛋白 （APC） 标记抗体作为表面标记物。孢子的定量是使用计数珠进行的，因为该技术在细胞检测方面表现出很高的准确性。使用流式细胞仪分析标记的孢子，证实了偶联。结果表明，DNA标记提高了流式细胞术定量的准确性，用于检测萌发的孢子。据观察，溴化乙锭不能标记休眠孢子;然而，该技术可以更精确地测定荧光蛋白与其表面偶联的孢子数量，从而有助于开展专注于在不同应用中使用孢子作为生物技术平台的研究。
Introduction
枯草芽孢杆菌是一种杆状革兰氏阳性细菌，当环境条件不允许细胞生长时，能够产生静止孢子1。孢子是极其稳定的细胞形式，包括枯草芽孢杆菌在内的几种物种的孢子被广泛用作人类和动物使用的益生菌2。由于其抗性和安全性，枯草芽孢杆菌的孢子显示异源蛋白，已被提议作为粘膜佐剂、疫苗递送系统和酶固定平台 3,4。
为了从枯草芽孢杆菌中获得孢子，有必要使用特殊的培养基将其暴露在营养剥夺中。在获得并纯化这些孢子后，必须对其进行定量以提高测试效率 5,6。因此，应用某些方法来分析所获得的孢子的浓度。可以使用平板计数和 Petroff-Hausser 室（也称为计数室）。后者最初是为了确定血细胞的浓度而开发的;但是，可以在微生物学领域将其用于孢子计数7,8。尽管是用于细胞计数的标准方法，但读取是费力的，因为这种方法完全是手动的，其准确性取决于操作员的经验。
基于流式细胞术 （FC） 的分析先前已被提议作为检测 芽孢杆菌属标记细胞的快速、可靠和特异性方法。使用流式细胞术计数珠保证了常规检查（CD4 和 CD8 T 淋巴细胞的绝对计数）中细胞计数的可重复性，以及涉及能够使用流式细胞术检测和计数的颗粒的研究的发展9。Godjafrey 和 Alsharif 建议使用计数珠子对未标记的孢子进行 FC 定量10。描述了使用流式细胞术监测 芽孢杆菌属 的孢子形成。通过标记孢子DNA 10、11、12、13。另一项研究使用 FC 来评估孢子表面荧光标记蛋白质的数量15。
本研究试图使用商业计数微球来确保使用流式细胞术进行事件计数的可重复性标准。在此，我们建议在FC中使用计数珠进行细胞计数，以优化孢子计数并评估荧光标记抗体在孢子表面的偶联效率。
Protocol
Representative Results
Discussion
传统方法，如菌落平板计数，不仅耗时，而且需要活细胞，并且不允许对灭活孢子进行定量5。Petroff-Hausser 室是一种替代方法，但它需要经验丰富的显微镜学家来执行。流式细胞术已被证明是实现此目的的有用替代方法。
Genovese等人12 描述了使用流式细胞术对 芽孢杆菌 的活细胞和孢子进行定量分析，使用两种核酸标记物和所用设备?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究的部分资金来自Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil （CAPES）-Finance Code 001;Governo do Estado do Amazonas，资源来自Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM;Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico （CNPq）.作者感谢健康工具技术发展计划PDTIS-FIOCRUZ使用其设施。
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
