Совершенствование нумерации спор Bacillus subtilis и анализа меток в проточной цитометрии
Summary
Этот протокол фокусируется на использовании проточной цитометрии и счетных шариков для количественного определения бактериальных спор, меченных бромидом этидия. Метод также эффективен для анализа ковалентного сцепления белков на поверхности интактных спор.
Abstract
Споры Bacillus subtilis уже были предложены для различных биотехнологических и иммунологических применений; Однако возрастает потребность в разработке методологий, улучшающих обнаружение антигенов, иммобилизованных на поверхности спор, и их количественного определения. Анализ на основе проточной цитометрии ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток B. subtilis. В данной работе мы предлагаем использовать проточную цитометрию для оценки эффективности отображения флуоресцентного антитела (ФА) на поверхности споры и количественной оценки количества спор с помощью счетных шариков.
Для этого мы использовали бромид этидия в качестве ДНК-маркера и антитело, меченное аллофикоцианином (APC), которое было связано со спорами, в качестве поверхностного маркера. Количественное определение спор проводили с помощью счетных шариков, так как этот метод демонстрирует высокую точность в обнаружении клеток. Меченые споры были проанализированы с помощью проточного цитометра, который подтвердил связь. В результате было продемонстрировано, что мечение ДНК повышает точность количественной оценки методом проточной цитометрии для обнаружения проросших спор. Было замечено, что бромид этидия не способен маркировать спящие споры; Тем не менее, этот метод обеспечивает более точное определение количества спор с флуоресцентным белком, связанным с их поверхностью, что помогает в развитии исследований, которые сосредоточены на использовании спор в качестве биотехнологической платформы в различных приложениях.
Introduction
Bacillus subtilis представляет собой палочковидную грамположительную бактерию, способную производить спокойные споры, когда условия окружающей среды не позволяют клеткам расти1. Споры являются чрезвычайно стабильными клеточными формами, и споры нескольких видов, включая B. subtilis, широко используются в качестве пробиотиков для использования человеком и животными2. Благодаря своей устойчивости и свойствам безопасности споры B. subtilis, которые демонстрируют гетерологичные белки, были предложены в качестве адъюванта слизистой оболочки, системы доставки вакцины и платформы иммобилизации ферментов 3,4.
Для получения спор из B. subtilis необходимо подвергнуть его депривации питательных веществ с помощью специальной питательной среды. После получения и очистки этих спор необходимо количественно оценить их для повышения эффективности теста 5,6. Таким образом, для анализа концентрации полученных спор применяются определенные методы. Можно использовать пластинчатый счет и камеру Петрова-Хауссера, также известную как счетная камера. Последний изначально был разработан для определения концентрации клеток крови; Однако возможно его использование в области микробиологии для подсчета спор 7,8. Несмотря на то, что это стандартный метод, используемый для подсчета клеток, чтение является трудоемким, так как этот метод полностью ручной, и его точность зависит от опыта оператора.
Анализ на основе проточной цитометрии (ФК) ранее был предложен в качестве быстрого, надежного и специфического подхода к обнаружению меченых клеток Bacillus spp. Использование гранул для подсчета клеток методом проточной цитометрии гарантирует воспроизводимость при подсчете клеток при рутинных исследованиях (абсолютное количество CD4 и CD8 Т-лимфоцитов) и при разработке исследований с участием частиц, которые могут быть обнаружены и подсчитаны с помощью проточной цитометрии9. Годжафри и Альшариф предложили использовать счетные шарики для количественной оценки немеченых спор10. Описано использование проточной цитометрии для мониторинга спороношения у Bacillus spp. путем мечения споровой ДНК 10,11,12,13. В другом исследовании FC использовали FC для оценки количества флуоресцентно меченных белков на поверхности споры15.
Это исследование было направлено на использование коммерческих счетных шариков для обеспечения стандарта воспроизводимости в отношении подсчета событий с помощью проточной цитометрии. В данной работе мы предлагаем использовать счетные шарики для подсчета клеток в ФК для уточнения нумерации спор и оценки эффективности связывания флуоресцентно меченных антител на поверхности спор.
Protocol
Representative Results
Discussion
Традиционные методы, такие как пластинчатый подсчет колоний, не только отнимают много времени, но и требуют жизнеспособных клеток и не позволяют количественно определить инактивированные споры5. Камера Петрова-Хауссера является альтернативной методикой, но для ее выполн?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично профинансировано Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) – Финансовый кодекс 001; Governo do Estado do Amazonas с ресурсами Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Авторы благодарят Программу технологического развития в области инструментов для здоровья PDTIS-FIOCRUZ за использование ее возможностей.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
