Verbetering van Bacillus subtilis sporentelling en labelanalyse in flowcytometrie
Summary
Dit protocol richt zich op het gebruik van flowcytometrie en het tellen van kralen om bacteriële sporen te kwantificeren die zijn gelabeld met ethidiumbromide. De methode is ook efficiënt voor het analyseren van de covalente koppeling van eiwitten op het oppervlak van intacte sporen.
Abstract
De sporen van Bacillus subtilis zijn al voorgesteld voor verschillende biotechnologische en immunologische toepassingen; Er is echter een toenemende behoefte aan de ontwikkeling van methodologieën die de detectie van geïmmobiliseerde antigenen op het oppervlak van sporen verbeteren, samen met hun kwantificering. Op flowcytometrie gebaseerde analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van B. subtilis. Hierin stellen we het gebruik van flowcytometrie voor om de weergave-efficiëntie van een fluorescerend antilichaam (FA) op het oppervlak van de spore te evalueren en het aantal sporen te kwantificeren met behulp van telkralen.
Hiervoor gebruikten we ethidiumbromide als DNA-marker en een allophycocyanine (APC)-gelabeld antilichaam, dat aan de sporen was gekoppeld, als oppervlaktemarker. De kwantificering van sporen werd uitgevoerd met behulp van telkralen, aangezien deze techniek een hoge nauwkeurigheid aantoont bij de detectie van cellen. De gelabelde sporen werden geanalyseerd met behulp van een flowcytometer, die de koppeling bevestigde. Als gevolg hiervan werd aangetoond dat DNA-etikettering de nauwkeurigheid van kwantificering door flowcytometrie verbeterde, voor de detectie van ontkiemde sporen. Er werd waargenomen dat ethidiumbromide niet in staat was om slapende sporen te labelen; Deze techniek zorgt echter voor een nauwkeurigere bepaling van het aantal sporen met fluorescerend eiwit gekoppeld aan hun oppervlak, wat helpt bij de ontwikkeling van studies die zich richten op het gebruik van sporen als biotechnologisch platform in verschillende toepassingen.
Introduction
Bacillus subtilis is een staafvormige, grampositieve bacterie die in staat is om slapende sporen te produceren wanneer de omgevingsomstandigheden geen celgroeitoelaten1. Sporen zijn uiterst stabiele celvormen en die van verschillende soorten, waaronder B. subtilis, worden veel gebruikt als probiotica voor menselijk en dierlijk gebruik. Vanwege zijn resistentie- en veiligheidseigenschappen is de spore van B. subtilis, die heterologe eiwitten vertoont, voorgesteld als een mucosale adjuvans, een vaccinafgiftesysteem en een enzym-immobilisatieplatform 3,4.
Om sporen van B. subtilis te verkrijgen, is het noodzakelijk om het bloot te stellen aan nutriëntendeprivatie met behulp van een speciaal kweekmedium. Na het verkrijgen en zuiveren van deze sporen, moet men ze kwantificeren om de testefficiëntie te verbeteren 5,6. Zo worden bepaalde methoden toegepast om de concentratie van de verkregen sporen te analyseren. Er kan gebruik worden gemaakt van het tellen van platen en een Petroff-Hausser-kamer, ook wel telkamer genoemd. De laatste is oorspronkelijk ontwikkeld om de concentratie van bloedcellen te bepalen; Het is echter mogelijk om het te gebruiken op het gebied van microbiologie voor het tellen van sporen 7,8. Ondanks dat het de standaardmethode is die wordt gebruikt voor het tellen van cellen, is het lezen arbeidsintensief omdat deze methode volledig handmatig is en de nauwkeurigheid ervan afhangt van de ervaring van de operator.
Op flowcytometrie gebaseerde (FC) analyses zijn eerder voorgesteld als snelle, betrouwbare en specifieke benaderingen voor het detecteren van gelabelde cellen van Bacillus spp. Het gebruik van flowcytometrie telparels heeft de reproduceerbaarheid gegarandeerd bij het tellen van cellen bij routineonderzoeken (absoluut aantal CD4- en CD8 T-lymfocyten) en bij de ontwikkeling van onderzoek met deeltjes die kunnen worden gedetecteerd en geteld met behulp van flowcytometrie9. Godjafrey en Alsharif suggereerden het gebruik van telkralen voor FC-kwantificering van niet-gelabelde sporen10. Het gebruik van flowcytometrie werd beschreven voor de monitoring van sporulatie in Bacillus spp. via het labelen van het sporen-DNA 10,11,12,13. Nog een andere studie gebruikte FC om de hoeveelheid fluorescerend gelabelde eiwitten op het sporenoppervlak te evalueren15.
Deze studie was gericht op het gebruik van commerciële telkralen om een standaard van reproduceerbaarheid te garanderen met betrekking tot het tellen van gebeurtenissen met behulp van flowcytometrie. Hierin suggereren we het gebruik van telkralen voor het tellen van cellen in FC om de sporentelling te verfijnen en de koppelingsefficiëntie van fluorescerend gelabelde antilichamen op het sporenoppervlak te evalueren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionele methoden, zoals het tellen van kolonies, zijn niet alleen tijdrovend, maar vereisen ook levensvatbare cellen en maken het niet mogelijk om geïnactiveerde sporen te kwantificeren5. De Petroff-Hausser-kamer is een alternatieve methodologie, maar vereist een ervaren microscopist om deze uit te voeren. Flowcytometrie is hiervoor een nuttig alternatief gebleken.
Genovese et al.12 beschreven het gebruik van flowcytometrie voor de kwantifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door de Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas met middelen van Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). De auteurs danken het Programma voor Technologische Ontwikkeling in Hulpmiddelen voor Gezondheid PDTIS-FIOCRUZ voor het gebruik van zijn faciliteiten.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
