שיפור של Bacillus subtilis ספירת נבגים וניתוח תוויות בציטומטריית זרימה
Summary
פרוטוקול זה מתמקד בשימוש בציטומטריית זרימה וספירת חרוזים כדי לכמת נבגי חיידקים המסומנים באתידיום ברומיד. השיטה יעילה גם לניתוח הצימוד הקוולנטי של חלבונים על פני השטח של נבגים שלמים.
Abstract
הנבגים של Bacillus subtilis כבר הוצעו ליישומים ביוטכנולוגיים ואימונולוגיים שונים; עם זאת, יש צורך הולך וגובר בפיתוח מתודולוגיות המשפרות את הזיהוי של אנטיגנים משותקים על פני השטח של נבגים יחד עם כימות שלהם. ניתוחים מבוססי ציטומטריית זרימה הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לאיתור תאים מסומנים של B. subtilis. כאן אנו מציעים להשתמש בציטומטריית זרימה כדי להעריך את יעילות התצוגה של נוגדן פלואורסצנטי (FA) על פני הנבג ולכמת את מספר הנבגים באמצעות ספירת חרוזים.
לשם כך השתמשנו באתידיום ברומיד כסמן דנ”א ובנוגדן עם תווית אלופיקוציאנין (APC), שהוצמד לנבגים, כסמן פני השטח. כימות הנבגים בוצע באמצעות ספירת חרוזים, שכן טכניקה זו מדגימה דיוק גבוה בזיהוי תאים. הנבגים המסומנים נותחו באמצעות ציטומטר זרימה, שאישר את הצימוד. כתוצאה מכך, הוכח כי תיוג DNA שיפר את דיוק הכימות על ידי ציטומטריית זרימה, לזיהוי נבגים מונבטים. נצפה כי אתידיום ברומיד לא היה מסוגל לתייג נבגים רדומים; עם זאת, טכניקה זו מספקת קביעה מדויקת יותר של מספר הנבגים עם חלבון פלואורסצנטי המצומד לפני השטח שלהם, ובכך מסייעת בפיתוח מחקרים המתמקדים בשימוש בנבגים כפלטפורמה ביוטכנולוגית ביישומים שונים.
Introduction
Bacillus subtilis הוא חיידק גראם-חיובי בצורת מוט המסוגל לייצר נבגים שקטים כאשר תנאי הסביבה אינם מאפשרים צמיחת תאים1. נבגים הם צורות תאים יציבות ביותר ואלה של כמה מינים, כולל B. subtilis, נמצאים בשימוש נרחב כפרוביוטיקה לשימוש בני אדם ובעלי חיים2. בשל תכונות העמידות והבטיחות שלו, הנבג של B. subtilis, המציג חלבונים הטרולוגיים, הוצע כאדג’ובנט רירי, מערכת אספקת חיסונים, ופלטפורמת אימוביליזציה של אנזימים 3,4.
כדי להשיג נבגים מ B. subtilis, יש צורך לחשוף אותו למחסור תזונתי באמצעות מדיום תרבות מיוחד. לאחר השגת נבגים אלה וטיהורם, יש לכמת אותם כדי לשפר את יעילות הבדיקה 5,6. לפיכך, שיטות מסוימות מיושמות כדי לנתח את ריכוז הנבגים המתקבלים. ניתן להשתמש בספירת לוחות ובתא פטרוף-האוסר, הידוע גם בשם תא ספירה. האחרון פותח במקור כדי לקבוע את ריכוז תאי הדם; עם זאת, ניתן להשתמש בו בתחום המיקרוביולוגיה לספירת נבגים 7,8. למרות היותה השיטה הסטנדרטית המשמשת לספירת תאים, הקריאה מייגעת מכיוון ששיטה זו ידנית לחלוטין והדיוק שלה תלוי בניסיון של המפעיל.
ניתוחים מבוססי ציטומטריה של זרימה (FC) הוצעו בעבר כגישות מהירות, אמינות וספציפיות לזיהוי תאים מסומנים של Bacillus spp. השימוש בציטומטריית זרימה לספירת חרוזים הבטיח יכולת שחזור בספירת תאים בבדיקות שגרתיות (ספירה מוחלטת של לימפוציטים מסוג CD4 ו-CD8 T) ובפיתוח מחקר המערב חלקיקים המסוגלים לגילוי ולספירה באמצעות ציטומטריית זרימה9. גודג’פרי ואלשריף הציעו להשתמש בספירת חרוזים לכימות FC של נבגים לא מסומנים10. השימוש בציטומטריית זרימה תואר לניטור נבגים ב– Bacillus spp. באמצעות תיוג DNA של נבג 10,11,12,13. מחקר נוסף השתמש ב-FC כדי להעריך את כמות החלבונים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג15.
מחקר זה ביקש להשתמש בחרוזי ספירה מסחריים כדי להבטיח סטנדרט של יכולת שחזור ביחס לספירת אירועים באמצעות ציטומטריית זרימה. כאן, אנו מציעים להשתמש בספירת חרוזים לספירת תאים ב- FC כדי לחדד את ספירת הנבגים ולהעריך את יעילות הצימוד של נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי על פני הנבג.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות מסורתיות, כגון ספירת לוחות של מושבות, אינן רק גוזלות זמן, אלא גם זקוקות לתאים בני קיימא ואינן מאפשרות כימות של נבגים בלתי פעילים5. תא פטרוף-האוזר הוא מתודולוגיה חלופית, אך נדרש מיקרוסקופיסט מנוסה כדי לבצע אותה. ציטומטריית זרימה הוכחה כחלופה שימושית למטרה זו.
<p class="jove_conte…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas עם משאבים מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). המחברים מודים לתוכנית לפיתוח טכנולוגי בכלים לבריאות PDTIS-FIOCRUZ על השימוש במתקניה.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
