フローサイトメトリーにおける 枯草菌 胞子の計数と標識解析の改善

Summary

このプロトコルは、フローサイトメトリーとカウントビーズを使用して、エチジウムブロマイドで標識された細菌胞子を定量化することに焦点を当てています。この方法は、無傷の胞子の表面におけるタンパク質の共有結合を分析するのにも効率的です。

Abstract

枯草菌の胞子は、さまざまなバイオテクノロジーおよび免疫学的用途のためにすでに提案されています。しかし、胞子の表面に固定化された抗原の検出とその定量を改善する方法論の開発の必要性が高まっています。フローサイトメトリーベースの解析は、枯草菌の標識細胞を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的なアプローチとして以前から提案されてきました。本研究では、フローサイトメトリーを用いて、胞子表面の蛍光抗体(FA)のディスプレイ効率を評価し、カウンティングビーズを用いて胞子の数を定量することを提案します。

このために、DNAマーカーとして臭化エチジウムを使用し、胞子に結合したアロフィコシアニン(APC)標識抗体を表面マーカーとして使用しました。胞子の定量は、細胞の検出において高い精度を示すため、計数ビーズを使用して行われました。標識された胞子をフローサイトメーターを用いて解析し、カップリングを確認しました。その結果、DNA標識により、発芽胞子の検出のためのフローサイトメトリーによる定量精度が向上することが実証されました。エチジウムブロマイドは休眠胞子を標識できないことが観察されました。しかし、この技術は、表面に蛍光タンパク質が結合した胞子の数をより正確に決定できるため、さまざまなアプリケーションにおけるバイオテクノロジープラットフォームとしての胞子の使用に焦点を当てた研究の開発に役立ちます。

Introduction

枯草菌は棒状のグラム陽性菌で、環境条件が細胞増殖を許さない場合に静止胞子を産生することができます¹。胞子は非常に安定した細胞形態であり、枯草菌を含むいくつかの種の胞子は、ヒトおよび動物用のプロバイオティクスとして広く使用されています²。枯草菌の胞子は、その耐性と安全性の特性から、異種タンパク質を示し、粘膜アジュバント、ワクチン送達システム、および酵素固定^{化プラットフォームとして}提案されている^3,4。

枯草菌から胞子を得るには、特別な培地を使用して栄養遮断にさらす必要があります。これらの胞子を入手して精製した後、検査効率を向上させるためにそれらを定量化する必要があります^5,6。したがって、得られた胞子の濃度を分析するために特定の方法が適用されます。プレートカウンティングと、カウンティングチャンバーとしても知られるペトロフ・ハウザーチャンバーを使用できます。後者はもともと血球の濃度を決定するために開発されました。しかし、胞^子計数のための微生物学の分野でそれを使用することは可能です^7,8。細胞計数に使用される標準的な方法であるにもかかわらず、この方法は完全に手作業であり、その精度はオペレーターの経験に依存するため、読み取りは面倒です。

フローサイトメトリー(FC)ベースの分析は、バチルス属菌の標識細胞を検出するための迅速で信頼性が高く、特異的なアプローチとして以前に提案されてきました。フローサイトメトリーカウンティングビーズの使用により、ルーチン検査(CD4およびCD8 Tリンパ球の絶対数)での細胞カウント、およびフローサイト^{メトリーを使用して}検出およびカウントできる粒子を含む研究の開発における再現性が保証されています9。GodjafreyとAlsharifは、非標識胞子のFC定量化にカウントビーズの使用を提案しました¹⁰。フローサイトメトリーの使用は、バチルス属菌の胞子形成のモニタリングについて説明されています。胞子^{DNA10,11,12,13}を標識する。さらに別の研究では、胞子表面上の蛍光標識タンパク質の量を評価するためにFCが用いられた¹⁵。

この研究では、市販のカウンティングビーズを使用して、フローサイトメトリーを使用したイベントカウンティングに関する再現性の基準を確保しようとしました。本研究では、胞子計数を精緻化し、胞子表面上の蛍光標識抗体の結合効率を評価するために、FCでの細胞計数に計数ビーズを使用することを提案します。

Protocol

このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアに関連する詳細については、 材料表 を参照してください。 1. フローサイトメトリーの設定 コンピュータと結合したフローサイトメーターの光学パラメータのアライメントCytometerソフトウェアにログインします。 ソフトウェアワークスペースから、 <st…

Representative Results

オートクレーブ滅菌した胞子(AS)サンプルでは、計数ビーズとPetroff-Hausser法を用いて、それぞれ2 × 103 胞子/μlおよび1 × 103 胞子/μlを検出しました(図2)。 図1:胞子の定量化の一般的なスキーム。(A)EtBrで標…

Discussion

コロニーのプレートカウントなどの従来の方法は、時間がかかるだけでなく、生細胞も必要であり、不活化胞子の定量は不可能です⁵。ペトロフ・ハウザーチャンバーは別の方法論ですが、それを実行するには経験豊富な顕微鏡技師が必要です。フローサイトメトリーは、この目的に有用な代替手段であることが証明されています。

Genovese et <sup class="xref…

Materials

((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC)	Sigma	341006
(N-hydroxysuccinimide) (NHS)	Sigma	130672
Anti-human fluorescent antibody	BioLegend	501410	APC anti-human IL-10
Anti-mouse fluorescent antibody	Thermo Scientific	A32723	Alexa Fluor Plus 488
BD FACSCanto II	BD		Flow cytometer
BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x)	BD	642412	Quality control reagent
BD FACSDiva Software v. 6.1.3	BD	643629	Software
Centrifuge MegaFuge 8R	Thermo Scientific	75007213
Counting Beads	BD	340334	TruCount Tubes
Eclipse 80i	Nikon		Fluorescent Microsope
Ethidium Bromide	Ludwig Biotec
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	A4503
Plastic Microtubes	Eppendorf
Polystyrene tube	Falcon	352008	5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile