Förbättring av Bacillus subtilis , sporräkning och etikettanalys i flödescytometri
Summary
Detta protokoll fokuserar på användningen av flödescytometri och räkning av pärlor för att kvantifiera bakteriesporer märkta med etidiumbromid. Metoden är också effektiv för att analysera den kovalenta bindningen av proteiner på ytan av intakta sporer.
Abstract
Sporerna av Bacillus subtilis har redan föreslagits för olika biotekniska och immunologiska tillämpningar; Det finns dock ett ökande behov av att utveckla metoder som förbättrar detektionen av antigener immobiliserade på ytan av sporer tillsammans med deras kvantifiering. Flödescytometribaserade analyser har tidigare föreslagits som snabba, tillförlitliga och specifika metoder för att detektera märkta celler av B. subtilis. Häri föreslår vi användning av flödescytometri för att utvärdera visningseffektiviteten hos en fluorescerande antikropp (FA) på sporens yta och kvantifiera antalet sporer med hjälp av räknande pärlor.
För detta använde vi etidiumbromid som DNA-markör och en allophycocyanin (APC)-märkt antikropp, som var kopplad till sporerna, som ytmarkör. Kvantifieringen av sporer utfördes med hjälp av räknepärlor eftersom denna teknik visar hög noggrannhet vid detektion av celler. De märkta sporerna analyserades med hjälp av en flödescytometer, som bekräftade kopplingen. Som ett resultat visade det sig att DNA-märkning förbättrade noggrannheten vid kvantifiering med flödescytometri för detektion av grodda sporer. Det observerades att etidiumbromid inte kunde märka vilande sporer; Denna teknik ger dock en mer exakt bestämning av antalet sporer med fluorescerande protein kopplat till deras yta, vilket hjälper till att utveckla studier som fokuserar på användningen av sporer som en bioteknisk plattform i olika applikationer.
Introduction
Bacillus subtilis är en stavformad, grampositiv bakterie som kan producera vilande sporer när miljöförhållandena inte tillåter celltillväxt1. Sporer är extremt stabila cellformer och sporer från flera arter, inklusive B. subtilis, används i stor utsträckning som probiotika för användning av människor och djur2. På grund av dess resistens och säkerhetsegenskaper har sporen av B. subtilis, som uppvisar heterologa proteiner, föreslagits som ett slemhinneadjuvans, ett vaccinleveranssystem och en enzymimmobiliseringsplattform 3,4.
För att få sporer från B. subtilis är det nödvändigt att utsätta den för näringsbrist med hjälp av ett speciellt odlingsmedium. Efter att ha erhållit och renat dessa sporer måste man kvantifiera dem för att förbättra testeffektiviteten 5,6. Således tillämpas vissa metoder för att analysera koncentrationen av de erhållna sporerna. Plåträkning och en Petroff-Hausser-kammare, även känd som en räknekammare, kan användas. Den senare utvecklades ursprungligen för att bestämma koncentrationen av blodkroppar; Det är dock möjligt att använda det inom mikrobiologi för sporräkning 7,8. Trots att det är standardmetoden som används för cellräkning är läsningen mödosam eftersom denna metod är helt manuell och dess noggrannhet beror på operatörens erfarenhet.
Flödescytometribaserade (FC) analyser har tidigare föreslagits som snabba, tillförlitliga och specifika metoder för att detektera märkta celler av Bacillus spp. Användningen av flödescytometri som räknar pärlor har garanterat reproducerbarhet vid cellräkning vid rutinundersökningar (absolut antal CD4- och CD8 T-lymfocyter) och vid utvecklingen av forskning som involverar partiklar som kan detekteras och räknas med hjälp av flödescytometri9. Godjafrey och Alsharif föreslog att man skulle använda sig av att räkna pärlor för FC-kvantifiering av omärkta sporer10. Användningen av flödescytometri beskrevs för övervakning av sporulation i Bacillus spp. genom märkning av spor-DNA 10,11,12,13. I en annan studie användes FC för att utvärdera mängden fluorescerande märkta proteiner på sporytan15.
Denna studie syftade till att använda kommersiella räknepärlor för att säkerställa en standard för reproducerbarhet med avseende på händelseräkning med hjälp av flödescytometri. Häri föreslår vi användning av räknepärlor för cellräkning i FC för att förfina sporräkningen och utvärdera kopplingseffektiviteten hos fluorescerande märkta antikroppar på sporytan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Traditionella metoder, såsom platträkning av kolonier, är inte bara tidskrävande, utan kräver också livskraftiga celler och tillåter inte kvantifiering av inaktiverade sporer5. Petroff-Hausser-kammaren är en alternativ metod, men den kräver en erfaren mikroskopist för att utföra den. Flödescytometri har visat sig vara ett användbart alternativ för detta ändamål.
Genovese et al.12 beskrev användningen av flödescytometri för kvan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades delvis av Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001; Governo do Estado do Amazonas med resurser från Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas-FAPEAM; Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Författarna tackar programmet för teknisk utveckling i verktyg för hälsa PDTIS-FIOCRUZ för användningen av dess faciliteter.
Materials
| ((1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (EDC) | Sigma | 341006 | |
| (N-hydroxysuccinimide) (NHS) | Sigma | 130672 | |
| Anti-human fluorescent antibody | BioLegend | 501410 | APC anti-human IL-10 |
| Anti-mouse fluorescent antibody | Thermo Scientific | A32723 | Alexa Fluor Plus 488 |
| BD FACSCanto II | BD | Flow cytometer | |
| BD FACSDiva Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (use with BD FACSDiva software v 6.x) | BD | 642412 | Quality control reagent |
| BD FACSDiva Software v. 6.1.3 | BD | 643629 | Software |
| Centrifuge MegaFuge 8R | Thermo Scientific | 75007213 | |
| Counting Beads | BD | 340334 | TruCount Tubes |
| Eclipse 80i | Nikon | Fluorescent Microsope | |
| Ethidium Bromide | Ludwig Biotec | ||
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Plastic Microtubes | Eppendorf | ||
| Polystyrene tube | Falcon | 352008 | 5 mL polystyrene tube, 12 x 75 mm, without lid, non-sterile |
References
- McKenney, P. T., Driks, A., Eichenberger, P. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature Reviews. Microbiology. 11 (1), 33-44 (2013).
- Cutting, S. M. Bacillus probiotics. Food Microbiology. 28 (2), 214-220 (2011).
- Ricca, E., Baccigalupi, L., Cangiano, G., De Felice, M., Isticato, R. Mucosal vaccine delivery by non-recombinant spores of Bacillus subtilis. Microbial Cell Factories. 13, 115 (2014).
- Falahati-Pour, S. K., Lotfi, A. S., Ahmadian, G., Baghizadeh, A. Covalent immobilization of recombinant organophosphorus hydrolase on spores of Bacillus subtilis. Journal of Applied Microbiology. 118 (4), 976-988 (2015).
- Harrold, Z., Hertel, M., Gorman-Lewis, D. Optimizing Bacillus subtilis spore isolation and quantifying spore harvest purity. Journal of Microbiological Methods. 87 (3), 325-329 (2011).
- Nicholson, W. L., Setlow, P. Sporulation, germination and outgrowth. Molecular biological methods for Bacillus. , (1990).
- Mora-Uribe, P., et al. Characterization of the adherence of Clostridium difficile spores: the integrity of the outermost layer affects adherence properties of spores of the epidemic strain R20291 to components of the intestinal mucosa. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 99 (2016).
- Paidhungat, M., Setlow, P. Role of ger proteins in nutrient and nonnutrient triggering of spore germination in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 182 (9), 2513-2519 (2000).
- Schnizlein-Bick, C., Spritzler, J., Wilkening, C., Nicholson, J., O’Gorman, M. Evaluation of TruCount absolute-count tubes for determining CD4 and CD8 cell numbers in human immunodeficiency virus-positive adults. Site Investigators and The NIAID DAIDS New Technologies Evaluation Group. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 7 (3), 336-343 (2000).
- Godfrey, A., Alsharif, R. Rapid enumeration of viable spores by flow cytometry. US Patent. , (2003).
- Karava, M., Bracharz, F., Kabisch, J. Quantification and isolation of Bacillus subtilis spores using cell sorting and automated gating. PLoS ONE. 14 (7), e021989 (2019).
- Genovese, M., Poulain, E., Doppler, F., Toussaint, R., Boyer, M. Bacillus spore enumeration using flow cytometry: A proof of concept for probiotic application. Journal of Microbiological Methods. 190, 106336 (2021).
- Trunet, C., Ngo, H., Coroller, L. Quantifying permeabilization and activity recovery of Bacillus spores in adverse conditions for growth. Food Microbiology. 81, 115-120 (2019).
- Tehri, N., Kumar, N., Raghu, H., Vashishth, A. Biomarkers of bacterial spore germination. Annals of Microbiology. 68, 513-523 (2018).
- Isticato, R., Ricca, E., Baccigalupi, L. Spore adsorption as a nonrecombinant display system for enzymes and antigens. Journal of Visualized Experiments. 145, e59102 (2019).
- Song, M., et al. Killed Bacillus subtilis spores as a mucosal adjuvant for an H5N1 vaccine. Vaccine. 30 (22), 3266-3277 (2012).
