नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट का निर्माण और लक्षण वर्णन
Summary
यहां, हम नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंटों के उत्पादन और लक्षण वर्णन का वर्णन करते हैं। एम्फोटेरिसिन बी नैनोडिस्क को चरणबद्ध तरीके से प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए एक उदाहरण के रूप में लिया जाता है।
Abstract
नैनोडिस्क शब्द एक असतत प्रकार के नैनोपार्टिकल को संदर्भित करता है जिसमें एक बाइलेयर बनाने वाला लिपिड, एक पाड़ प्रोटीन और एक एकीकृत बायोएक्टिव एजेंट शामिल होता है। नैनोडिस्क को डिस्क के आकार के लिपिड बाइलेयर के रूप में व्यवस्थित किया जाता है जिसका परिमाप पाड़ प्रोटीन द्वारा सीमित होता है, आमतौर पर विनिमय योग्य एपोलिपोप्रोटीन परिवार का सदस्य होता है। कई हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को कण के लिपिड बाइलेयर के हाइड्रोफोबिक वातावरण में उनके एकीकरण द्वारा नैनोडिस्क में कुशलतापूर्वक घुलनशील किया गया है, जिससे व्यास में 10-20 एनएम की सीमा में कणों की काफी हद तक समरूप आबादी उत्पन्न होती है। नैनोडिस्क के निर्माण के लिए अलग-अलग घटकों के सटीक अनुपात की आवश्यकता होती है, प्रत्येक घटक का एक उपयुक्त अनुक्रमिक जोड़, इसके बाद फॉर्मूलेशन मिश्रण का स्नान सोनिकेशन होता है। एम्फीपैथिक पाड़ प्रोटीन अनायास लिपिड / बायोएक्टिव एजेंट मिश्रण बनाने वाले बिखरे हुए बाईलेयर से संपर्क करता है और नैनोडिस्क कणों की एक असतत, सजातीय आबादी बनाने के लिए पुनर्गठित करता है। इस प्रक्रिया के दौरान, प्रतिक्रिया मिश्रण एक अपारदर्शी, टर्बिड उपस्थिति से एक स्पष्ट नमूने में बदल जाता है, जो पूरी तरह से अनुकूलित होने पर, सेंट्रीफ्यूजेशन पर कोई अवक्षेप उत्पन्न नहीं करता है। लक्षण वर्णन अध्ययनों में बायोएक्टिव एजेंट घुलनशीलता दक्षता, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी, पराबैंगनी दृश्यमान (यूवी / विस) अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और / या प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी का निर्धारण शामिल है। यह आम तौर पर सुसंस्कृत कोशिकाओं या चूहों का उपयोग करके जैविक गतिविधि की जांच के बाद होता है। एंटीबायोटिक (यानी, मैक्रोलाइड पॉलीएन एंटीबायोटिक एम्फोटेरिसिन बी) को परेशान करने वाले नैनोडिस्क के मामले में, एकाग्रता या समय के कार्य के रूप में खमीर या कवक के विकास को रोकने की उनकी क्षमता को मापा जा सकता है। सूत्रीकरण की सापेक्ष आसानी, घटक भागों के संबंध में बहुमुखी प्रतिभा, नैनोस्केल कण आकार, अंतर्निहित स्थिरता, और जलीय घुलनशीलता नैनोडिस्क प्रौद्योगिकी के विट्रो और विवो अनुप्रयोगों में असंख्य की अनुमति देती है। वर्तमान लेख में, हम हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंट के रूप में एम्फोटेरिसिन बी युक्त नैनोडिस्क तैयार करने और चिह्नित करने के लिए एक सामान्य पद्धति का वर्णन करते हैं।
Introduction
नवजात डिस्कोइडल उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) स्वाभाविक रूप से मानव संचार प्रणाली में मौजूद कहीं अधिक प्रचुर मात्रा में गोलाकार एचडीएल के पूर्वज हैं। इन नवजात कणों, जिन्हें प्री-बी एचडीएल भी कहा जाता है, में अद्वितीय और विशिष्टसंरचनात्मक गुण होते हैं। दरअसल, एक गोलाकार कण के रूप में मौजूद होने के बजाय, नवजात एचडीएल डिस्क के आकार के होते हैं। प्राकृतिक और पुनर्गठित डिस्कोइडल एचडीएल पर व्यापक संरचनात्मक लक्षण वर्णन अध्ययनों से पता चला है कि वे एक फॉस्फोलिपिड बाइलेयर से युक्त होते हैं जिनकी परिधि एक एम्फीपैथिक विनिमय योग्य एपोलिपोप्रोटीन (एपीओ) द्वारा सीमित होती है, जैसे कि एपीओए-आई। मानव लिपोप्रोटीन चयापचय में, परिसंचारी नवजात एचडीएल परिधीय कोशिकाओं से लिपिड प्राप्त करते हैं और एक प्रक्रिया में गोलाकार एचडीएल में परिपक्व होते हैं जो एटीपी बाइंडिंग कैसेट ट्रांसपोर्टर ए 1 और लेसिथिन: कोलेस्ट्रॉल एसाइलट्रांसफर्स2 सहित प्रमुख प्रोटीन मध्यस्थों पर निर्भर होता है। यह प्रक्रिया रिवर्स कोलेस्ट्रॉल परिवहन मार्ग के एक महत्वपूर्ण घटक का प्रतिनिधित्व करती है जिसे हृदय रोग के खिलाफ सुरक्षात्मक माना जाता है। इस ज्ञान और डिस्कोइडल एचडीएल के पुनर्गठन की क्षमता से लैस, शोधकर्ताओं ने एथेरोस्क्लेरोसिस 3 के इलाज के लिए चिकित्सीय हस्तक्षेप के रूप में इन कणों को नियोजित कियाहै। संक्षेप में, रोगियों में पुनर्गठित एचडीएल (आरएचडीएल) का जलसेक पट्टिका जमा से कोलेस्ट्रॉल एफ्लक्स को बढ़ावा देता है और पित्त एसिड में रूपांतरण और शरीर से उत्सर्जन के लिए इसे यकृत में लौटाता है। कई जैव प्रौद्योगिकी/फार्मास्युटिकल कंपनियां इसउपचार रणनीति का अनुसरण कर रही हैं।
साथ ही, प्रयोगशाला में इन कणों को उत्पन्न करने की क्षमता ने अनुसंधान गतिविधियों की झड़ी लगा दी है जिसने नए अनुप्रयोगों और नई प्रौद्योगिकियों को जन्म दिया है। एक प्रमुख अनुप्रयोग में देशी जैसे वातावरण में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को घर देने के लिए लघु झिल्ली के रूप में आरएचडीएलकणों का उपयोग शामिल है। आज तक, सैकड़ों प्रोटीनों को सफलतापूर्वक डिस्कोइडल आरएचडीएल में शामिल किया गया है, और अनुसंधान से पता चला है कि ये प्रोटीन रिसेप्टर्स, एंजाइम, ट्रांसपोर्टर्स आदि के रूप में देशी रचना और जैविक गतिविधि दोनों को बनाए रखते हैं। इन कणों, जिन्हें “नैनोडिस्क” के रूप में जाना जाता है, को संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उत्तरदायी दिखाया गया है, अक्सर उच्च रिज़ॉल्यूशन6 पर। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन की जांच के लिए इस दृष्टिकोण को डिटर्जेंट मिसेल या लिपोसोम के साथ अध्ययन से बेहतर माना जाता है और परिणामस्वरूप, तेजी से आगे बढ़ रहा है। यह पहचानना महत्वपूर्ण है कि दो अलग-अलग तरीकों की सूचना दी गई है जो एक आरएचडीएल बनाने में सक्षम हैं। “चोलेट डायलिसिस” विधि13 आरएचडीएल बाइलेयर5 में ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के समावेश से संबंधित अनुप्रयोगों के लिए लोकप्रिय है। अनिवार्य रूप से, सूत्रीकरण की इस विधि में डिटर्जेंट सोडियम कोलेट (या सोडियम डीऑक्सीकोलेट; मिसेल आणविक भार [एमडब्ल्यू] 4,200 डीए) युक्त बफर में फॉस्फोलिपिड, एक पाड़ प्रोटीन और ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन बनाने वाले एक बाईलेयर को मिलाना शामिल है। डिटर्जेंट प्रभावी रूप से विभिन्न प्रतिक्रिया घटकों को घुलनशील करता है, जिससे नमूने को डिटर्जेंट की कमी वाले बफर के खिलाफ डायलाइज्ड करने की अनुमति मिलती है। डायलिसिस चरण के दौरान, जैसे ही डिटर्जेंट को नमूने से हटा दिया जाता है, एक आरएचडीएल अनायास बनता है। जब इस दृष्टिकोण का उपयोग रुचि के ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को फंसाने के लिए किया जाता है, तो उत्पाद कणों को नैनोडिस्क5 कहा जाता है। छोटे अणु हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों (एमडब्ल्यू <1,000 डीए) को शामिल करने के लिए इस विधि का उपयोग करने के प्रयास, हालांकि, काफी हद तक असफल रहे हैं। ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन के विपरीत, छोटे अणु बायोएक्टिव एजेंट डिटर्जेंट के साथ डायलिसिस बैग से बचने में सक्षम होते हैं, जिससे आरएचडीएल में उनकी निगमन दक्षता बहुत कम हो जाती है। इस समस्या को फॉर्मूलेशन मिश्रण14 से डिटर्जेंट को छोड़कर हल किया गया था। इसके बजाय, घटकों को क्रमिक रूप से एक जलीय बफर में जोड़ा जाता है, जो लिपिड बनाने वाले बाईलेयर से शुरू होता है, जो आरएचडीएल युक्त एक स्थिर बायोएक्टिव एजेंट बनाता है, जिसे नैनोडिस्क कहा जाता है। दूसरों ने विवो इमेजिंग एजेंटों 7 में निगमन और परिवहन के लिए आरएचडीएल का उपयोगकिया है। हाल ही में, विशेष आरएचडीएल में एक एपोलिपोप्रोटीन पाड़ और आयनिक ग्लाइसेरोफॉस्फोलिपिड, कार्डियोलिपिन शामिल हैं, को लिगैंड बाइंडिंग अध्ययनों में नियोजित किया गया है। ये कण कैल्शियम, साइटोक्रोम सी और एंटीकैंसर एजेंट डॉक्सोर्यूबिसिन8 सहित विभिन्न पानी घुलनशील लिगेंड के साथ कार्डियोलिपिन की बातचीत के अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं।
वर्तमान अध्ययन का ध्यान आरएचडीएल के निर्माण पर है जिसमें एक स्थिर रूप से शामिल हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंट (यानी नैनोडिस्क) है। डिस्कोइडल आरएचडीएल कणों के लिपिड परिवेश में एकीकृत करने के लिए इन एजेंटों की क्षमता प्रभावी रूप से उन्हें जलीय घुलनशीलता प्रदान करती है। जैसे, नैनोडिस्क में विवो चिकित्सीय अनुप्रयोगों में क्षमता है। नैनोडिस्क तैयार करते समय, उत्पाद कण में असतत हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को सफलतापूर्वक शामिल करने के लिए विशिष्ट इनक्यूबेशन / प्रतिक्रिया स्थितियों की आवश्यकता होती है, और इस रिपोर्ट का लक्ष्य विस्तृत व्यावहारिक जानकारी प्रदान करना है जिसे विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए नए नैनोडिस्क कणबनाने के लिए एक मूलभूत टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जा सकता है। इस प्रकार, इस पांडुलिपि के संदर्भ में नैनोडिस्क और नैनोडिस्क शब्द विनिमेय नहीं हैं। जबकि नैनोडिस्क एक आरएचडीएल को संदर्भित करता है जो इसके लिपिड बाइलेयर5 में एम्बेडेड एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटीन को शामिल करने के लिए तैयार किया जाता है, नैनोडिस्क शब्द कम आणविक भार (< 1,000 डीए) हाइड्रोफोबिक बायोएक्टिव एजेंटों को शामिल करने के लिए तैयार किए गए आरएचडीएल को संदर्भित करता है, जैसे एम्फोटेरिसिन बी14।
उपयुक्त पाड़ प्रोटीन के अधिग्रहण के लिए विभिन्न प्रकार के तरीके उपलब्ध हैं। निर्माताओं से पाड़ प्रोटीन खरीदना संभव है [जैसे एपीओए-आई (एसआरपी 4693) या एपीओई 4 (ए 3234)], हालांकि, लागत एक सीमित कारक हो सकती है। एक पसंदीदा दृष्टिकोण एस्चेरिचिया कोलाई में पुनः संयोजक पाड़ प्रोटीन को व्यक्त करना है। प्रोटोकॉल मानव एपीओए –1 9, एपीओई 410, साथ ही कीट हेमोलिम्फ प्रोटीन एपोलिपोफोरिन –3 11 के लिए प्रकाशित किए गए हैं। यहां वर्णित प्रयोगों के उद्देश्य के लिए, पुनः संयोजक मानव एपीओई 4 एन-टर्मिनल (एनटी) डोमेन (एमिनो एसिड 1-183) का उपयोग किया गया था। मानव एपीओई 4-एनटी को एन्कोडिंग करने वाले न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को संश्लेषित किया गया था और वेक्टर-एन्कोडेड पेलबी लीडर अनुक्रम से सीधे सटे पीईटी -22 बी (+) अभिव्यक्ति वेक्टर में डाला गया था। यह निर्माण एक पीईएलबी लीडर अनुक्रम-एपीओई 4-एनटी संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। प्रोटीन संश्लेषण के बाद, बैक्टीरियल पेलबी लीडर अनुक्रम नए संश्लेषित प्रोटीन को पेरिप्लाज्मिक स्पेस में निर्देशित करता है जहां लीडर पेप्टिडेस पेलबी अनुक्रम को छोड़ देता है। परिणामी एपीओई 4-एनटी प्रोटीन, जिसमें कोई अनुक्रम टैग या पूंछ नहीं है, बाद में बैक्टीरिया से बच जाता है और कल्चर माध्यम11,12 में जमा होता है, डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण को सरल बनाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नैनोडिस्क युक्त बायोएक्टिव एजेंट का निर्माण अन्यथा अघुलनशील हाइड्रोफोबिक यौगिकों को घुलनशील करने के लिए एक सुविधाजनक विधि प्रदान करता है। क्योंकि उत्पाद बायोएक्टिव एजेंट नैनोडिस्क जलीय मीडिया मे…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (आर 37 एचएल -64159) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
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