صياغة وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا المحتوية على أقراص نانوية
Summary
هنا ، نصف إنتاج وتوصيف العوامل النشطة بيولوجيا التي تحتوي على أقراص نانوية. تؤخذ أقراص الأمفوتريسين B النانوية كمثال لوصف البروتوكول بطريقة تدريجية.
Abstract
يشير مصطلح القرص النانوي إلى نوع منفصل من الجسيمات النانوية يتكون من طبقة ثنائية تشكل الدهون ، وبروتين سقالة ، وعامل نشط بيولوجيا متكامل. يتم تنظيم الأقراص النانوية كطبقة ثنائية دهنية على شكل قرص يحيط محيطها ببروتين السقالة ، وعادة ما يكون عضوا في عائلة البروتين الشحمي القابل للتبادل. تم إذابة العديد من العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء بكفاءة في الأقراص النانوية من خلال دمجها في الوسط الكارهة للماء للطبقة المزدوجة الدهنية للجسيمات ، مما ينتج عنه مجموعة متجانسة إلى حد كبير من الجسيمات في نطاق 10-20 نانومتر في القطر. تتطلب صياغة الأقراص النانوية نسبة دقيقة من المكونات الفردية ، وإضافة متسلسلة مناسبة لكل مكون ، تليها صوتنة الحمام لخليط الصياغة. يتصل بروتين السقالة البرمائية تلقائيا ويعيد تنظيم الطبقة المزدوجة المشتتة التي تشكل خليط من الدهون / العامل النشط بيولوجيا لتشكيل مجموعة منفصلة ومتجانسة من جزيئات الأقراص النانوية. خلال هذه العملية ، ينتقل خليط التفاعل من مظهر عكر معتم إلى عينة موضحة ، عند تحسينها بالكامل ، لا تنتج أي ترسب عند الطرد المركزي. تتضمن دراسات التوصيف تحديد كفاءة ذوبان العوامل النشطة بيولوجيا ، والمجهر الإلكتروني ، وكروماتوغرافيا الترشيح الهلامي ، والتحليل الطيفي للامتصاص المرئي فوق البنفسجي (UV / Vis) ، و / أو التحليل الطيفي الفلوري. يتبع ذلك عادة تحقيق النشاط البيولوجي باستخدام الخلايا المستزرعة أو الفئران. في حالة الأقراص النانوية التي تحتوي على مضاد حيوي (أي مضاد حيوي ماكرولايد بوليين أمفوتريسين ب) ، يمكن قياس قدرتها على تثبيط نمو الخميرة أو الفطريات كدالة للتركيز أو الوقت. إن السهولة النسبية للصياغة ، والتنوع فيما يتعلق بالأجزاء المكونة ، وحجم الجسيمات النانوية ، والاستقرار المتأصل ، والذوبان المائي تسمح بعدد لا يحصى من التطبيقات في المختبر وفي الجسم الحي لتكنولوجيا الأقراص النانوية. في هذه المقالة ، نصف منهجية عامة لصياغة وتوصيف الأقراص النانوية التي تحتوي على الأمفوتريسين B كعامل نشط بيولوجيا كاره للماء.
Introduction
البروتينات الدهنية عالية الكثافة القرصية الوليدة (HDLs) هي أسلاف تحدث بشكل طبيعي ل HDL الكروي الأكثر وفرة الموجود في الدورة الدموية البشرية. هذه الجسيمات الوليدة ، التي يشار إليها أيضا باسم HDL pre-ß ، تمتلك خصائص هيكلية فريدة ومميزة1. في الواقع ، بدلا من الوجود كجسيم كروي ، فإن HDLs الوليدة على شكل قرص. كشفت دراسات التوصيف الهيكلي المكثفة على HDLs القرصية الطبيعية والمعاد تشكيلها أنها تتكون من طبقة ثنائية فوسفوليبيد محيطها محاط ببروتين شحمي برمائي قابل للتبادل (apo) ، مثل apoA-I. في استقلاب البروتين الدهني البشري ، تتراكم HDLs الوليدة المنتشرة الدهون من الخلايا المحيطية وتنضج إلى HDLs كروية في عملية تعتمد على وسطاء البروتين الرئيسيين ، بما في ذلك ناقل الكاسيت المرتبط ATP A1 والليسيثين: الكوليسترول acyltransferse2. تمثل هذه العملية مكونا مهما في مسار نقل الكوليسترول العكسي الذي يعتبر وقائيا ضد أمراض القلب. مسلحين بهذه المعرفة والقدرة على إعادة تكوين HDLs القرصية ، استخدم الباحثون هذه الجسيمات كتدخل علاجي لعلاج تصلب الشرايين3. في جوهرها ، فإن ضخ HDL المعاد تشكيله (rHDL) في المرضى يعزز تدفق الكوليسترول من رواسب البلاك ويعيده إلى الكبد لتحويله إلى الأحماض الصفراوية وإفرازه من الجسم. تتبع العديد من شركات التكنولوجيا الحيوية / الأدوية استراتيجية العلاجهذه 4.
في الوقت نفسه ، أثارت القدرة على توليد هذه الجسيمات في المختبر موجة من الأنشطة البحثية التي أدت إلى تطبيقات جديدة وتقنيات جديدة. يتضمن أحد التطبيقات البارزة استخدام جزيئات rHDL كغشاء مصغر لإيواء البروتينات عبر الغشاء في بيئة شبيهة بالسكانالأصليين 5. حتى الآن ، تم دمج مئات البروتينات بنجاح في rHDL القرصي ، وأظهرت الأبحاث أن هذه البروتينات تحتفظ بكل من التشكل الأصلي والنشاط البيولوجي كمستقبلات وإنزيمات وناقلات ، إلخ. كما ثبت أن هذه الجسيمات ، التي يشار إليها باسم “الأقراص النانوية” ، قابلة للتوصيف الهيكلي ، غالبا بدقةعالية 6. من المسلم به أن هذا النهج في التحقيقات في البروتينات عبر الغشاء متفوق على الدراسات التي أجريت على مذيلات المنظفات أو الجسيمات الشحمية ، ونتيجة لذلك ، يتقدم بسرعة. من المهم أن ندرك أنه تم الإبلاغ عن طريقتين متميزتين قادرتين على تشكيل rHDL. طريقة “غسيل الكلى cholate”13 شائعة للتطبيقات المتعلقة بدمج البروتينات عبر الغشاء في طبقة rHDLثنائية الطبقة 5. بشكل أساسي ، تتضمن طريقة الصياغة هذه خلط طبقة ثنائية تشكل الفوسفوليبيد ، وبروتين سقالة ، وبروتين عبر الغشاء مهم في مخزن مؤقت يحتوي على كولات الصوديوم المنظف (أو ديوكسي كولات الصوديوم ؛ الوزن الجزيئي للمذيلة [MW] من 4200 Da). يعمل المنظف على إذابة مكونات التفاعل المختلفة بشكل فعال ، مما يسمح بغسيل العينة ضد المخزن المؤقت الذي يفتقر إلى المنظفات. أثناء خطوة غسيل الكلى ، عند إزالة المنظف من العينة ، يتشكل rHDL تلقائيا. عندما يتم استخدام هذا النهج لمحاصرة بروتين عبر الغشاء محل الاهتمام ، فقد تم تسمية جزيئات المنتج بالأقراص النانوية5. ومع ذلك ، فإن محاولات استخدام هذه الطريقة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا الكارهة للماء ذات الجزيئات الصغيرة (MW <1000 Da) ، لم تنجح إلى حد كبير. على عكس البروتينات عبر الغشاء ، فإن العوامل النشطة بيولوجيا للجزيئات الصغيرة قادرة على الهروب من كيس غسيل الكلى مع المنظف ، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة دمجها في rHDLs. تم حل هذه المشكلة عن طريق حذف المنظفات من خليط التركيبة14. بدلا من ذلك ، تتم إضافة المكونات إلى مخزن مائي بالتتابع ، بدءا من الطبقة الثنائية المكونة للدهون ، مما يشكل عاملا نشطا بيولوجيا مستقرا يحتوي على rHDL ، يشار إليه باسم القرص النانوي. استخدم آخرون rHDL لدمج ونقل عوامل التصوير في الجسم الحي 7. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام rHDL المتخصصة المكونة من سقالة البروتين الشحمي والدهون الغليسيروفوسفوليبيد الأنيونية ، الكارديوليبين ، في دراسات ربط اليجند. توفر هذه الجسيمات منصة لدراسات تفاعل الكارديوليبين مع مختلف الروابط القابلة للذوبان في الماء ، بما في ذلك الكالسيوم والسيتوكروم ج والعامل المضاد للسرطان دوكسوروبيسين8.
ينصب تركيز هذه الدراسة على صياغة rHDL التي تمتلك عاملا نشطا بيولوجيا مسعورا مدمجا بشكل مستقر (أي قرص نانوي). إن قدرة هذه العوامل على الاندماج في الوسط الدهني لجزيئات rHDL القرصية تمنحها بشكل فعال قابلية الذوبان المائي. على هذا النحو ، فإن الأقراص النانوية لديها القدرة على التطبيقات العلاجية في الجسم الحي . عند صياغة الأقراص النانوية ، يلزم وجود ظروف حضانة / تفاعل محددة لدمج العوامل النشطة بيولوجيا المنفصلة الكارهة للماء بنجاح في جسيم المنتج ، والهدف من هذا التقرير هو توفير معلومات عملية مفصلة يمكن استخدامها كقالب أساسي لإنشاء جزيئات نانوية جديدة لتطبيقات محددة. وبالتالي ، في سياق هذه المخطوطة ، فإن المصطلحين nanodisc و nanodisk غير قابلين للتبادل. في حين يشير القرص النانوي إلى rHDL المركب ليحتوي على بروتين عبر الغشاء مضمن في طبقة الدهونالمزدوجة 5 ، يشير مصطلح nanodisk إلى rHDL المصمم لدمج عوامل نشطة بيولوجيا منخفضة الوزن الجزيئي (< 1000 Da) ، مثل الأمفوتريسين B14.
تتوفر مجموعة متنوعة من الطرق للحصول على بروتينات سقالة مناسبة. من الممكن شراء بروتينات سقالة من الشركات المصنعة [مثل apoA-I (SRP4693) أو apoE4 (A3234)] ، ومع ذلك ، قد تكون التكلفة عاملا مقيدا. النهج المفضل هو التعبير عن بروتينات السقالة المؤتلفة في الإشريكية القولونية. يتم نشر البروتوكولات للإنسان apoA-I9 ، apoE410 ، وكذلك بروتين الهيموليمف الحشري apolipophorin-III11. لغرض التجارب الموصوفة هنا ، تم استخدام مجال apoE4 N-terminal (NT) البشري المؤتلف (الأحماض الأمينية 1-183). تم تصنيع تسلسل النوكليوتيدات الذي يشفر apoE4-NT البشري وإدخاله في متجه تعبير pET-22b (+) مجاور مباشرة لتسلسل قائد pelB المشفر بالمتجهات. يؤدي هذا البناء إلى التعبير عن بروتين اندماج تسلسل pelB – apoE4-NT. بعد تخليق البروتين ، يوجه تسلسل قائد pelB البكتيري البروتين المركب حديثا إلى الفضاء المحيطي حيث يشق الببتيداز القائد تسلسل pelB. بروتين apoE4-NT الناتج ، بدون علامات تسلسل أو ذيول ، يهرب لاحقا من البكتيريا ويتراكم في وسط الاستزراع11,12 ، مما يبسط المعالجة النهائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر صياغة عامل نشط بيولوجيا يحتوي على أقراص نانوية طريقة ملائمة لإذابة المركبات الكارهة للماء غير القابلة للذوبان. نظرا لأن الأقراص النانوية للعامل النشط بيولوجيا للمنتج قابلة للذوبان بالكامل في الوسائط المائية ، فإنها توفر طريقة توصيل مفيدة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكارهة للماء (<str…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (R37 HL-64159).
Materials
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
- Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
- Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
- Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
- Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
- Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
- Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
- Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
- Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
- Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
- Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
- Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
- Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
- Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
- Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
- Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
- Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
- Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
- Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
- Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
- Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
- Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
- Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
- Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
- Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
- Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
- Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
- Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
- Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
- Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
- Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
- Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
- Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
- Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
- Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
- Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).
