나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형 및 특성화
Summary
여기에서는 나노디스크를 포함하는 생리활성제의 생산 및 특성화에 대해 설명합니다. 암포테리신 B 나노디스크는 프로토콜을 단계적으로 설명하기 위한 예로 사용됩니다.
Abstract
나노디스크라는 용어는 이중층 형성 지질, 스캐폴드 단백질 및 통합 생리활성제로 구성된 개별 유형의 나노입자를 의미합니다. 나노 디스크는 디스크 모양의 지질 이중층으로 구성되며, 그 둘레는 스캐 폴드 단백질, 일반적으로 교환 가능한 아포지 단백질 계열의 구성원으로 둘러싸여 있습니다. 수많은 소수성 생리활성제는 입자의 지질 이중층의 소수성 환경에 통합되어 나노디스크에서 효율적으로 용해되어 직경 10-20nm 범위의 대체로 균질한 입자 집단을 생성합니다. 나노 디스크의 제형은 개별 성분의 정확한 비율, 각 성분의 적절한 순차적 첨가, 제형 혼합물의 목욕 초음파 처리가 필요합니다. 양친매성 스캐폴드 단백질은 분산된 이중층 형성 지질/생리활성제 혼합물을 자발적으로 접촉하고 재구성하여 나노디스크 입자의 분리되고 균질한 집단을 형성합니다. 이 과정에서 반응 혼합물은 불투명하고 탁한 모양에서 완전히 최적화되면 원심분리 시 침전물이 생성되지 않는 정제된 샘플로 전환됩니다. 특성화 연구에는 생리활성제 가용화 효율, 전자 현미경, 겔 여과 크로마토그래피, 자외선 가시광선(UV/Vis) 흡광도 분광법 및/또는 형광 분광법의 측정이 포함됩니다. 이것은 일반적으로 배양 된 세포 또는 마우스를 사용하여 생물학적 활성을 조사합니다. 항생제(즉, 마크로라이드 폴리엔 항생제 암포테리신 B)를 함유하는 나노디스크의 경우, 농도 또는 시간의 함수로서 효모 또는 진균의 성장을 억제하는 능력을 측정할 수 있습니다. 제형의 상대적 용이성, 구성 부품에 대한 다양성, 나노 스케일 입자 크기, 고유 안정성 및 수용성은 나노 디스크 기술의 무수한 시험관 내 및 생체 내 응용을 허용합니다. 본 논문에서, 우리는 소수성 생리활성제로서 암포테리신 B를 함유하는 나노디스크를 공식화하고 특성화하는 일반적인 방법론을 설명한다.
Introduction
초기 원반형 고밀도 지단백질(HDL)은 인간 순환계에 존재하는 훨씬 더 풍부한 구형 HDL의 자연 발생 전구체입니다. pre-ß HDL이라고도 하는 이러한 초기 입자는 독특하고 독특한 구조적 특성을 가지고 있습니다1. 실제로, 초기 HDL은 구상 입자로 존재하는 것이 아니라 디스크 모양입니다. 자연 및 재구성 원반형 HDL에 대한 광범위한 구조적 특성화 연구는 주변이 apoA-I와 같은 양친매성 교환 가능한 아포지단백(apo)으로 둘러싸인 인지질 이중층으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 인간 지단백질 대사에서 순환하는 초기 HDL은 말초 세포에서 지질을 축적하고 ATP 결합 카세트 수송체 A1 및 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼제2를 포함한 주요 단백질 매개체에 의존하는 과정에서 구형 HDL로 성숙합니다. 이 과정은 심장 질환을 예방하는 것으로 간주되는 역 콜레스테롤 수송 경로의 중요한 구성 요소를 나타냅니다. 이러한 지식과 원반형 HDL을 재구성할 수 있는 능력으로 무장한 연구자들은 이러한 입자를 죽상동맥경화증을 치료하기 위한 치료적 중재로 사용했다3. 본질적으로, 환자에게 재구성 된 HDL (rHDL)을 주입하면 플라크 침전물에서 콜레스테롤 유출을 촉진하고 담즙산으로 전환하고 신체에서 배설하기 위해 간으로 되돌립니다. 여러 생명공학/제약회사들이 이 치료 전략을 추구하고 있다4.
동시에 실험실에서 이러한 입자를 생성하는 능력은 새로운 응용 분야와 새로운 기술로 이어진 연구 활동을 촉발했습니다. 한 가지 두드러진 응용 분야는 rHDL 입자를 미니어처 멤브레인으로 사용하여 네이티브와 같은 환경에서 막횡단 단백질을 수용하는 것입니다5. 현재까지 수백 개의 단백질이 원반형 rHDL에 성공적으로 통합되었으며 연구에 따르면 이러한 단백질은 수용체, 효소, 수송체 등과 같은 기본 형태와 생물학적 활성을 모두 유지합니다. “나노디스크(nanodiscs)”라고 불리는 이 입자들은 종종 고분해능(high resolution)에서 구조적 특성화에 적합한 것으로 나타났다6. 막횡단 단백질 조사에 대한 이러한 접근 방식은 세제 미셀이나 리포솜을 사용한 연구보다 우수한 것으로 인식되고 있으며 그 결과 빠르게 발전하고 있습니다. rHDL을 형성할 수 있는 두 가지 별개의 방법이 보고되었음을 인식하는 것이 중요합니다. “콜레이트 투석” 방법(13 )은 rHDL 이중층(5)에 막횡단 단백질을 혼입시키는 것과 관련된 응용에 널리 사용된다. 본질적으로, 이러한 제형 방법은 세제인 소듐 콜레이트 (또는 소듐 데옥시콜레이트; 4,200 Da의 미셀 분자량 [MW])를 함유하는 완충제에서 이중층 형성 인지질, 스캐폴드 단백질, 및 관심있는 막횡단 단백질을 혼합하는 것을 포함한다. 세제는 다양한 반응 성분을 효과적으로 용해시켜 세제가 부족한 완충액에 대해 시료를 투석할 수 있도록 합니다. 투석 단계에서 세제가 샘플에서 제거됨에 따라 rHDL이 자발적으로 형성됩니다. 이 접근법이 관심 있는 막횡단 단백질을 포획하는 데 사용될 때, 생성물 입자는 나노디스크(nanodisc)5라고 불린다. 그러나 이 방법을 사용하여 소분자 소수성 생리활성제(MW<1,000Da)를 통합하려는 시도는 대체로 성공적이지 못했습니다. 막횡단 단백질과 달리 저분자 생리활성제는 세제와 함께 투석 백에서 빠져나갈 수 있어 rHDL로의 결합 효율을 크게 감소시킵니다. 이 문제는 배합혼합물(14)에서 세제를 생략함으로써 해결되었다. 대신에, 성분들은 지질을 형성하는 이중층으로부터 시작하여, 나노디스크로 지칭되는 rHDL을 함유하는 안정한 생리활성제를 형성하면서, 수성 완충액에 순차적으로 첨가된다. 다른 연구자들은 생체 내 이미징 에이전트의 혼입 및 수송을 위해 rHDL을 사용했다7. 보다 최근에는 아포지단백 스캐폴드와 음이온성 글리세로인지질인 카디오리핀으로 구성된 특수 rHDL이 리간드 결합 연구에 사용되었습니다. 이 입자는 카디오리핀과 칼슘, 시토크롬 c, 항암제인 독소루비신을 포함한 다양한 수용성 리간드의 상호작용을 연구하기 위한 플랫폼을 제공한다8.
본 연구의 초점은 안정적으로 통합된 소수성 생리활성제(즉, 나노디스크)를 보유하는 rHDL의 제형에 있습니다. 원반형 rHDL 입자의 지질 환경에 통합하는 이러한 제제의 능력은 효과적으로 수용성을 부여합니다. 따라서 나노디스크는 생체 내 치료 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다. 나노디스크를 제조할 때, 분리된 소수성 생리활성제를 제품 입자에 성공적으로 통합하기 위해서는 특정 배양/반응 조건이 필요하며, 이 보고서의 목표는 특정 응용 분야를 위한 새로운 나노디스크 입자를 만들기 위한 기본 템플릿으로 사용할 수 있는 상세한 실용적인 정보를 제공하는 것입니다. 따라서 이 원고의 맥락에서 나노디스크와 나노디스크라는 용어는 서로 바꿔 사용할 수 없습니다. 나노디스크는 그의 지질 이중층(5)에 매립된 막횡단 단백질을 함유하도록 제형화된 rHDL을 의미하는 반면, 나노디스크라는 용어는 암포테리신B14와 같은 저분자량(< 1,000Da) 소수성 생리활성제를 혼입하도록 제형화된 rHDL을 의미한다.
적합한 스캐폴드 단백질의 획득을 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 스캐폴드 단백질을 제조업자로부터 구입할 수 있지만[예를 들어, apoA-I (SRP4693) 또는 apoE4 (A3234)], 그러나 비용이 제한 요인이 될 수 있다. 바람직한 접근법은 대장균에서 재조합 스캐폴드 단백질을 발현하는 것이다. 인간 apoA-I9, apoE410 및 곤충 체액 림프 단백질 apolipophorin-III11에 대한 프로토콜이 발표되었습니다. 본원에 기재된 실험의 목적을 위해, 재조합 인간 apoE4 N-말단 (NT) 도메인 (아미노산 1-183)을 사용하였다. 인간 apoE4-NT를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 합성하여 벡터-코딩된 pelB 리더 서열에 직접 인접한 pET-22b(+) 발현 벡터에 삽입하였다. 이러한 구축물은 pelB 리더 서열-apoE4-NT 융합 단백질의 발현을 유도한다. 단백질 합성 후, 박테리아 pelB 리더 서열은 새로 합성된 단백질을 리더 펩티다아제가 pelB 서열을 절단하는 주변세포질 공간으로 유도합니다. 서열 태그 또는 꼬리가 없는 생성된 apoE4-NT 단백질은 이후 박테리아를 빠져나와 배양 배지11,12에 축적되어 다운스트림 처리를 단순화합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
나노디스크를 함유하는 생리활성제의 제형은 달리 불용성인 소수성 화합물을 가용화하는 편리한 방법을 제공한다. 생성물 생리활성제 나노디스크는 수성 매질에 완전히 용해되기 때문에 광범위한 소수성 분자에 대한 유용한 전달 방법을 제공합니다(표 1). 여기에는 소분자, 천연 및 합성 약물, 식물 영양소, 호르몬 등이 포함됩니다. 제형 전략은 일반적으로 유기 용매에서 생리 활성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 국립 보건원 (National Institutes of Health) (R37 HL-64159)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Amphotericin B | Cayman Chemical Company | 11636 | ND Formulation & Standard Preparation |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP17925 | Transformation & Expansion |
| ApoE4-NT Plasmid | GenScript | N/A | Transformation |
| Baffled Flask | New Brunswick Scientific | N/A | Expansion & Expression |
| BL21 competent E coli | New England Biolabs | C2527I | Transformation |
| Centrifuge bottles | Nalgene | 3140-0250 | Expression |
| Chloroform | Fisher Scientific | G607-4 | ND Formulation |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | Standard Prepartation |
| Dymyristoylphosphatidylcholine | Avanti Lipids | 850345P | ND Formulation |
| Erlenmeyer flask | Bellco Biotechnology | N/A | Expansion & Expression |
| Falcon Tubes | Sarstedt Ag & Co | D51588 | Yeast Viability Assay |
| Glass borosilicate tubes | VWR | 47729-570 | ND Formulation |
| GraphPad (Software) | Dotmatics | N/A | Yeast Viability Assay |
| Heated Sonication Bath | VWR | N/A | ND Formulaton |
| Heating and Nitrogen module | Thermo Scientific | TS-18822 | ND Formulation |
| HiTrap Heparin HP (5 mL) | GE Healthcare | 17-0407-03 | Purification |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Fisher Scientific | BP1755 | Expression |
| J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | J325-IM-2 | Expression |
| JA-14 Rotor | Beckman Coulter | 339247 | Expression |
| Lyophilizer | Labconco | 7755030 | ND Formulation |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | ND Formulation |
| Nitrogen gas | Praxair | UN1066 | ND Formulation |
| NZCYM media | RPI Research Products | N7200-1000.0 | Expansion & Expression |
| Pet-22B vector | GenScript | N/A | Transformation |
| Petri dish | Fisher Scientific | FB0875718 | Transformation & Expansion |
| Quartz Cuvettes | Fisher Brand | 14385 928A | Spectral Analysis |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | M1344-0004 | Transformation, Expansion, & Expression |
| Slide-A-Lyzer Buoys | Thermo Scientific | 66430 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 68100 | Purification |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo Scientific | 88243 | Purification |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271 | Purification |
| Sodium Phosphate dibasic | Fisher Scientific | S374-500 | Purification |
| Sodium Phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-500 | Purification |
| Spectra/POR Weighted Closures | Spectrum Medical Industries | 132736 | Purification |
| Spectrophotometer | Shimadzu UV-1800 | 220-92961-01 | spectral analysis |
| Tabletop Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | ND Formulation |
| UVProbe 2.61 (Software) | Shimadzu | N/A | Spectral Analysis |
| Vacuum filter | Millipore | 9004-70-0 | Expression & Purification |
| Vacuum pump | GAST Manufacturing Inc | DOA-P704-AA | Expression & Purification |
| Vortex | Fisher Scientific | 12-812 | ND Formulation |
| Yeast | N/A | BY4741 | Yeast Viability Assay |
| Yeast Extract-Peptone-Dextrose | BD | 242820 | Yeast Viability Assay |
References
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