Formulación y caracterización de nanodiscos que contienen agentes bioactivos

Summary

Aquí, describimos la producción y caracterización de agentes bioactivos que contienen nanodiscos. Los nanodiscos de anfotericina B se toman como ejemplo para describir el protocolo de manera gradual.

Abstract

El término nanodisco se refiere a un tipo discreto de nanopartícula compuesta por un lípido formador de bicapa, una proteína de andamio y un agente bioactivo integrado. Los nanodiscos están organizados como una bicapa lipídica en forma de disco cuyo perímetro está circunscrito por la proteína del andamio, generalmente un miembro de la familia de apolipoproteínas intercambiables. Numerosos agentes bioactivos hidrófobos se han solubilizado eficientemente en nanodiscos mediante su integración en el medio hidrofóbico de la bicapa lipídica de la partícula, produciendo una población en gran medida homogénea de partículas en el rango de 10-20 nm de diámetro. La formulación de nanodiscos requiere una proporción precisa de componentes individuales, una adición secuencial apropiada de cada componente, seguida de la sonicación en baño de la mezcla de formulación. La proteína del andamio anfipático contacta y reorganiza espontáneamente la bicapa dispersa formando una mezcla de lípidos / agentes bioactivos para formar una población discreta y homogénea de partículas de nanodiscos. Durante este proceso, la mezcla de reacción pasa de una apariencia opaca y turbia a una muestra clarificada que, cuando está completamente optimizada, no produce precipitado tras la centrifugación. Los estudios de caracterización implican la determinación de la eficiencia de solubilización del agente bioactivo, microscopía electrónica, cromatografía de filtración en gel, espectroscopia de absorbancia ultravioleta visible (UV / Vis) y / o espectroscopia de fluorescencia. Esto normalmente es seguido por una investigación de la actividad biológica utilizando células cultivadas o ratones. En el caso de los nanodiscos que albergan un antibiótico (es decir, el antibiótico polieno macrólido anfotericina B), se puede medir su capacidad para inhibir el crecimiento de levaduras u hongos en función de la concentración o el tiempo. La relativa facilidad de formulación, versatilidad con respecto a las partes componentes, tamaño de partícula a nanoescala, estabilidad inherente y solubilidad acuosa permite innumerables aplicaciones in vitro e in vivo de la tecnología de nanodiscos. En el presente artículo, describimos una metodología general para formular y caracterizar nanodiscos que contienen anfotericina B como agente bioactivo hidrófobo.

Introduction

Las lipoproteínas discoidales de alta densidad (HDL) nacientes son progenitores naturales del HDL esférico mucho más abundante presente en el sistema circulatorio humano. Estas partículas nacientes, también denominadas pre-ß HDL, poseen propiedades estructurales únicas y distintivas¹. De hecho, en lugar de existir como una partícula esferoidal, las HDL nacientes tienen forma de disco. Extensos estudios de caracterización estructural en HDL discoidales naturales y reconstituidas han revelado que están compuestas por una bicapa de fosfolípidos cuyo perímetro está circunscrito por una apolipoproteína anfipática intercambiable (apo), como apoA-I. En el metabolismo de las lipoproteínas humanas, las HDL nacientes circulantes acumulan lípidos de las células periféricas y maduran en HDL esféricas en un proceso que depende de mediadores de proteínas clave, incluido el transportador de casete de unión a ATP A1 y la lecitina: aciltransfersa^{de colesterol 2}. Este proceso representa un componente crítico de la vía de transporte inverso del colesterol que se considera protector contra las enfermedades del corazón. Armados con este conocimiento y la capacidad de reconstituir HDL discoidales, los investigadores han empleado estas partículas como una intervención terapéutica para tratar la aterosclerosis³. En esencia, la infusión de HDL reconstituido (rHDL) en pacientes promueve el flujo de colesterol de los depósitos de placa y lo devuelve al hígado para su conversión en ácidos biliares y excreción del cuerpo. Varias empresas biotecnológicas/farmacéuticas están aplicando esta estrategia de tratamiento⁴.

Al mismo tiempo, la capacidad de generar estas partículas en el laboratorio ha provocado una ráfaga de actividades de investigación que ha llevado a nuevas aplicaciones y nuevas tecnologías. Una aplicación destacada implica el uso de partículas de rHDL como una membrana en miniatura para albergar proteínas transmembrana en un ambiente nativo⁵. Hasta la fecha, cientos de proteínas se han incorporado con éxito en la rHDL discoidal, y la investigación ha demostrado que estas proteínas conservan tanto la conformación nativa como la actividad biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Estas partículas, denominadas “nanodiscos”, también han demostrado ser susceptibles de caracterización estructural, a menudo a alta resolución⁶. Este enfoque para las investigaciones de proteínas transmembrana se reconoce como superior a los estudios con micelas detergentes o liposomas y, como resultado, está avanzando rápidamente. Es importante reconocer que se han reportado dos métodos distintos que son capaces de formar una rHDL. El método de “diálisis de colato”¹³ es popular para aplicaciones relacionadas con la incorporación de proteínas transmembrana en la bicapa⁵ de rHDL. Esencialmente, este método de formulación implica mezclar una bicapa formando fosfolípido, una proteína de andamio y la proteína transmembrana de interés en un tampón que contiene el detergente colato de sodio (o desoxicolato de sodio; peso molecular de micela [MW] de 4.200 Da). El detergente solubiliza eficazmente los diferentes componentes de la reacción, permitiendo que la muestra se dialice contra el tampón que carece de detergente. Durante el paso de diálisis, a medida que se retira el detergente de la muestra, se forma espontáneamente una rHDL. Cuando este enfoque se utiliza para atrapar una proteína transmembrana de interés, las partículas del producto se han denominado nanodiscos⁵. Sin embargo, los intentos de utilizar este método para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de moléculas pequeñas (MW <1.000 Da) han sido en gran medida infructuosos. A diferencia de las proteínas transmembrana, los agentes bioactivos de moléculas pequeñas pueden escapar de la bolsa de diálisis junto con el detergente, disminuyendo en gran medida su eficiencia de incorporación en las rHDL. Este problema se resolvió omitiendo detergentes de la mezcla de formulación¹⁴. En cambio, los componentes se agregan a un tampón acuoso secuencialmente, comenzando con la bicapa formando lípidos, formando un agente bioactivo estable que contiene rHDL, denominado nanodisco. Otros han utilizado la rHDL para la incorporación y transporte de agentes de imagen in vivo ⁷. Más recientemente, se han empleado en estudios de unión de ligandos rHDL especializados compuestos por un andamio de apolipoproteína y el glicerofosfolípido aniónico, cardiolipina. Estas partículas proporcionan una plataforma para estudios de la interacción de la cardiolipina con varios ligandos solubles en agua, incluyendo calcio, citocromo c y el agente anticancerígeno doxorrubicina⁸.

El presente estudio se centra en la formulación de rHDL que poseen un agente bioactivo hidrofóbico incorporado de manera estable (es decir, nanodisco). La capacidad de estos agentes para integrarse en el medio lipídico de las partículas discoidales de rHDL les confiere efectivamente solubilidad acuosa. Como tal, los nanodiscos tienen el potencial para aplicaciones terapéuticas in vivo . Al formular nanodiscos, se requieren condiciones específicas de incubación / reacción para incorporar con éxito agentes bioactivos hidrófobos discretos en la partícula del producto, y el objetivo de este informe es proporcionar información práctica detallada que pueda usarse como plantilla fundamental para crear nuevas partículas de nanodiscos para aplicaciones específicas. Por lo tanto, en el contexto de este manuscrito los términos nanodisco y nanodisco no son intercambiables. Mientras que nanodisco se refiere a un rHDL formulado para contener una proteína transmembrana incrustada en su bicapa lipídica⁵, el término nanodisco se refiere a un rHDL formulado para incorporar agentes bioactivos hidrófobos de bajo peso molecular (< 1.000 Da), como la anfotericina B¹⁴.

Una variedad de métodos están disponibles para la adquisición de proteínas de andamio adecuadas. Es posible comprar proteínas de andamio de fabricantes [por ejemplo, apoA-I (SRP4693) o apoE4 (A3234)], sin embargo, el costo puede ser un factor limitante. Un enfoque preferido es expresar proteínas de andamio recombinantes en Escherichia coli. Se publican protocolos para la apoA-I⁹ humana, apoE4¹⁰, así como para la proteína hemolinfática del insecto apolipoforina-III¹¹. Para los experimentos descritos en la presente invención, se utilizó el dominio N-terminal (NT) apoE4 humano recombinante (aminoácidos 1-183). La secuencia de nucleótidos que codifica apoE4-NT humano se sintetizó y se insertó en un vector de expresión pET-22b (+) directamente adyacente a la secuencia líder pelB codificada por vectores. Esta construcción conduce a la expresión de una proteína de fusión pelB leader sequence-apoE4-NT. Después de la síntesis de proteínas, la secuencia líder bacteriana pelB dirige la proteína recién sintetizada al espacio periplásmico donde la peptidasa líder escinde la secuencia pelB. La proteína apoE4-NT resultante, sin etiquetas de secuencia ni colas, escapa posteriormente de las bacterias y se acumula en el medio de cultivo^11,12, simplificando el procesamiento posterior.

Protocol

1. Transformación, expresión y purificación del componente proteico del andamio Transformación bacteriana BL21 con plásmido que contiene apoE4-NTDescongele un tubo de células competentes BL21 (DE3) en hielo durante 10 min. Una vez que todo el hielo se haya derretido, mezclar suave y cuidadosamente pipetear 50 μL de las células en un tubo de transformación sobre hielo. Añadir 5 μL que contengan 50 ng de ADN plásmido (para la secuencia, véase la …

Representative Results

Proceso de formulación de nanodiscos de agentes bioactivosEn el procedimiento de formulación de nanodiscos ampB descrito, la reacción se considera completa cuando la apariencia de la muestra pasa de turbia a clara (Figura 1). Este cambio indica que se han formado nanodiscos y que el agente bioactivo ha sido solubilizado. A menudo, los agentes bioactivos absorben la luz en la región de longitud de onda visible (por ejemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q10…

Discussion

La formulación de un agente bioactivo que contiene nanodiscos proporciona un método conveniente para solubilizar compuestos hidrófobos insolubles. Debido a que los nanodiscos de agentes bioactivos del producto son completamente solubles en medios acuosos, proporcionan un método de administración útil para una amplia gama de moléculas hidrófobas (Tabla 1). Estos incluyen moléculas pequeñas, drogas naturales y sintéticas, fitonutrientes, hormonas, etc. La estrategia de formulación generalmente …

Materials

Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay