Summary

Formulering en karakterisering van bioactieve stof die nanoschijven bevat

Published: March 17, 2023
doi:

Summary

Hier beschrijven we de productie en karakterisering van bioactieve stoffen die nanoschijven bevatten. Amfotericine B nanoschijven worden als voorbeeld genomen om het protocol stapsgewijs te beschrijven.

Abstract

De term nanoschijf verwijst naar een discreet type nanodeeltje dat bestaat uit een tweelaags lipide, een steigereiwit en een geïntegreerd bioactief middel. Nanoschijven zijn georganiseerd als een schijfvormige lipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door het steigereiwit, meestal een lid van de uitwisselbare apolipoproteïnefamilie. Talrijke hydrofobe bioactieve stoffen zijn efficiënt opgelost in nanoschijven door hun integratie in het hydrofobe milieu van de lipide bilayer van het deeltje, wat een grotendeels homogene populatie deeltjes oplevert in het bereik van 10-20 nm in diameter. De formulering van nanoschijven vereist een nauwkeurige verhouding van individuele componenten, een geschikte sequentiële toevoeging van elke component, gevolgd door badsonificatie van het formuleringsmengsel. Het amfipathische scaffold-eiwit maakt spontaan contact met en reorganiseert het gedispergeerde dubbellaagse mengsel van lipide / bioactieve stof om een discrete, homogene populatie van nanoschijfdeeltjes te vormen. Tijdens dit proces gaat het reactiemengsel over van een ondoorzichtig, troebel uiterlijk naar een geklaard monster dat, wanneer het volledig is geoptimaliseerd, geen neerslag oplevert bij centrifugeren. Karakteriseringsstudies omvatten de bepaling van de oplosefficiëntie van bioactieve stoffen, elektronenmicroscopie, gelfiltratiechromatografie, ultraviolet zichtbare (UV / Vis) absorptiespectroscopie en / of fluorescentiespectroscopie. Dit wordt normaal gesproken gevolgd door een onderzoek naar biologische activiteit met behulp van gekweekte cellen of muizen. In het geval van nanoschijven die een antibioticum bevatten (d.w.z. het macrolide polyeenantibioticum amfotericine B), kan hun vermogen om de groei van gist of schimmels te remmen als functie van concentratie of tijd worden gemeten. Het relatieve gemak van formulering, veelzijdigheid met betrekking tot componenten, deeltjesgrootte op nanoschaal, inherente stabiliteit en waterige oplosbaarheid maakt talloze in vitro en in vivo toepassingen van nanoschijftechnologie mogelijk. In dit artikel beschrijven we een algemene methodologie om nanoschijven die amfotericine B bevatten te formuleren en te karakteriseren als het hydrofobe bioactieve middel.

Introduction

Ontluikende discoïdale lipoproteïnen met hoge dichtheid (HDL’s) zijn van nature voorkomende voorlopers van het veel overvloedigere bolvormige HDL dat aanwezig is in de menselijke bloedsomloop. Deze ontluikende deeltjes, ook wel pre-ß HDL genoemd, bezitten unieke en onderscheidende structurele eigenschappen1. Inderdaad, in plaats van te bestaan als een sferoïdaal deeltje, zijn ontluikende HDL’s schijfvormig. Uitgebreide structurele karakteriseringsstudies op natuurlijke en gereconstitueerde discoïdale HDLs hebben aangetoond dat ze bestaan uit een fosfolipide bilayer waarvan de omtrek wordt begrensd door een amfipathisch uitwisselbaar apolipoproteïne (apo), zoals apoA-I. In het metabolisme van menselijke lipoproteïneën bouwen circulerende ontluikende HDL’s lipiden op uit perifere cellen en rijpen ze tot bolvormige HDLs in een proces dat afhankelijk is van belangrijke eiwitmediatoren, waaronder de ATP-bindingscassettetransporter A1 en lecithine: cholesterolacyltransferse2. Dit proces vertegenwoordigt een cruciaal onderdeel van de omgekeerde cholesteroltransportroute die wordt beschouwd als beschermend tegen hartaandoeningen. Gewapend met deze kennis en het vermogen om discoïdale HDLs te reconstitueren, hebben onderzoekers deze deeltjes gebruikt als een therapeutische interventie om atherosclerose3 te behandelen. In wezen bevordert de infusie van gereconstitueerd HDL (rHDL) bij patiënten cholesterolefflux uit plaqueafzettingen en brengt het terug naar de lever voor omzetting in galzuren en uitscheiding uit het lichaam. Verschillende biotechnologie/farmaceutische bedrijven volgen deze behandelingsstrategie4.

Tegelijkertijd heeft het vermogen om deze deeltjes in het laboratorium te genereren geleid tot een vlaag van onderzoeksactiviteiten die heeft geleid tot nieuwe toepassingen en nieuwe technologieën. Een prominente toepassing betreft het gebruik van rHDL-deeltjes als een miniatuurmembraan om transmembraaneiwitten te huisvesten in een native-achtige omgeving5. Tot op heden zijn honderden eiwitten met succes opgenomen in discoïdale rHDL, en onderzoek heeft aangetoond dat deze eiwitten zowel inheemse conformatie als biologische activiteit behouden als receptoren, enzymen, transporters, enz. Van deze deeltjes, aangeduid als “nanodiscs”, is ook aangetoond dat ze vatbaar zijn voor structurele karakterisering, vaak met een hoge resolutie6. Deze benadering van onderzoek naar transmembraaneiwitten wordt erkend als superieur aan studies met detergentenmicellen of liposomen en vordert als gevolg daarvan snel. Het is belangrijk om te erkennen dat er twee verschillende methoden zijn gemeld die in staat zijn om een rHDL te vormen. De “cholaatdialyse” methode13 is populair voor toepassingen die verband houden met de opname van transmembraaneiwitten in de rHDL bilayer5. In wezen omvat deze formuleringsmethode het mengen van een tweelaagse fosfolipide, een steigereiwit en het transmembraaneiwit van belang in een buffer die het detergent natriumcholaat (of natriumdeoxycholaat; micelmolecuulgewicht [MW] van 4.200 Da) bevat. Het reinigingsmiddel lost de verschillende reactiecomponenten effectief op, waardoor het monster kan worden gedialyseerd tegen buffergebrek aan reinigingsmiddel. Tijdens de dialysestap, als het wasmiddel uit het monster wordt verwijderd, vormt zich spontaan een rHDL. Wanneer deze benadering wordt gebruikt om een transmembraaneiwit van belang in de val te lokken, worden de productdeeltjes nanodiscs5 genoemd. Pogingen om deze methode te gebruiken om hydrofobe bioactieve stoffen met kleine moleculen (MW <1.000 Da) op te nemen, zijn echter grotendeels mislukt. In tegenstelling tot transmembraaneiwitten kunnen bioactieve stoffen met kleine moleculen samen met het wasmiddel uit de dialysezak ontsnappen, waardoor hun opname-efficiëntie in rHDLs sterk afneemt. Dit probleem werd opgelost door detergentia weg te laten uit het formuleringsmengsel14. In plaats daarvan worden de componenten achtereenvolgens aan een waterige buffer toegevoegd, te beginnen met de tweelaagse die lipide vormt, waardoor een stabiel bioactief middel wordt gevormd dat rHDL bevat, een nanoschijf genoemd. Anderen hebben rHDL gebruikt voor de opname en het transport van in vivo beeldvormende middelen7. Meer recent zijn gespecialiseerde rHDL, bestaande uit een apolipoproteïnesteiger en de anionische glycerofosfolipide, cardiolipine, gebruikt in ligandbindingsstudies. Deze deeltjes bieden een platform voor studies naar de interactie van cardiolipine met verschillende in water oplosbare liganden, waaronder calcium, cytochroom c en het antikankermiddel doxorubicine8.

De focus van deze studie ligt op de formulering van rHDL die een stabiel opgenomen hydrofoob bioactief middel (d.w.z. nanoschijf) bezitten. Het vermogen van deze middelen om te integreren in het lipidemilieu van discoïdale rHDL-deeltjes verleent ze effectief waterige oplosbaarheid. Als zodanig hebben nanoschijven het potentieel voor in vivo therapeutische toepassingen. Bij het formuleren van nanoschijven zijn specifieke incubatie- / reactieomstandigheden vereist om met succes discrete hydrofobe bioactieve stoffen in het productdeeltje op te nemen, en het doel van dit rapport is om gedetailleerde praktische informatie te bieden die kan worden gebruikt als een fundamentele sjabloon voor het maken van nieuwe nanoschijfdeeltjes voor specifieke toepassingen. In de context van dit manuscript zijn de termen nanodisc en nanodisk dus niet uitwisselbaar. Terwijl nanodisc verwijst naar een rHDL geformuleerd om een transmembraaneiwit te bevatten dat is ingebed in zijn lipide bilayer5, verwijst de term nanodisk naar een rHDL geformuleerd om hydrofobe bioactieve stoffen met een laag molecuulgewicht (< 1.000 Da) op te nemen, zoals amfotericine B14.

Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de verwerving van geschikte steigereiwitten. Het is mogelijk om steigereiwitten te kopen van fabrikanten [bijv. apoA-I (SRP4693) of apoE4 (A3234)], maar de kosten kunnen een beperkende factor zijn. Een voorkeursbenadering is om recombinante steigereiwitten tot expressie te brengen in Escherichia coli. Protocollen zijn gepubliceerd voor humaan apoA-I9, apoE410, evenals het insect hemolymfe-eiwit apolipophorin-III11. Voor de hierin beschreven experimenten werd gebruik gemaakt van recombinant humaan apoE4 N-terminale (NT) domein (aminozuren 1-183). De nucleotidesequentie die codeert voor menselijk apoE4-NT werd gesynthetiseerd en ingevoegd in een pET-22b (+) expressievector direct grenzend aan de vectorgecodeerde pelB-leidersequentie. Dit construct leidt tot de expressie van een pelB leader sequence-apoE4-NT fusie-eiwit. Na eiwitsynthese leidt de bacteriële pelB-leidersequentie het nieuw gesynthetiseerde eiwit naar de periplasmatische ruimte waar leider peptidase de pelB-sequentie splitst. Het resulterende apoE4-NT-eiwit, zonder sequentietags of staarten, ontsnapt vervolgens aan de bacteriën en hoopt zich op in het kweekmedium11,12, waardoor de verwerking stroomafwaarts wordt vereenvoudigd.

Protocol

1. Transformatie, expressie en zuivering van steigereiwitcomponent BL21 bacteriële transformatie met apoE4-NT bevattend plasmideOntdooi een buisje BL21 (DE3) competente cellen op ijs gedurende 10 min. Zodra al het ijs is gesmolten, mengt u voorzichtig en voorzichtig pipet 50 μL van de cellen in een transformatiebuis op ijs. Voeg 5 μL met 50 ng plasmide-DNA (voor sequentie, zie aanvullende tabel 1) toe aan het celmengsel. Veeg voorzichtig vier of…

Representative Results

Bioactief middel nanoschijf formuleringsprocesIn de beschreven ampB-nanoschijfformuleringsprocedure wordt de reactie als voltooid beschouwd wanneer het uiterlijk van het monster overgaat van troebel naar helder (figuur 1). Deze verandering geeft aan dat nanoschijven zijn gevormd en dat het bioactieve middel is opgelost. Vaak absorberen bioactieve stoffen licht in het zichtbare golflengtegebied (bijv. AmpB, curcumine, luteïne, co-enzym Q10) en in deze gevallen…

Discussion

Formulering van een bioactief middel dat nanoschijven bevat, biedt een handige methode om anders onoplosbare hydrofobe verbindingen op te lossen. Omdat de nanoschijven van het bioactieve middel van het product volledig oplosbaar zijn in waterige media, bieden ze een nuttige toedieningsmethode voor een breed scala aan hydrofobe moleculen (tabel 1). Deze omvatten kleine moleculen, natuurlijke en synthetische drugs, fytonutriënten, hormonen, enz. De formuleringsstrategie volgt meestal een standaardprotocol…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (R37 HL-64159).

Materials

Amphotericin B Cayman Chemical Company 11636 ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin Fisher Scientific BP17925 Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid GenScript N/A Transformation
Baffled Flask New Brunswick Scientific N/A Expansion & Expression
BL21 competent E coli New England Biolabs C2527I Transformation
Centrifuge bottles Nalgene 3140-0250 Expression
Chloroform Fisher Scientific G607-4 ND Formulation
DMSO Sigma Aldrich 472301 Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine Avanti Lipids 850345P ND Formulation
Erlenmeyer flask Bellco Biotechnology N/A Expansion & Expression
Falcon Tubes Sarstedt Ag & Co D51588 Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes VWR 47729-570 ND Formulation
GraphPad (Software) Dotmatics N/A Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath VWR N/A ND Formulaton
Heating and Nitrogen module Thermo Scientific TS-18822 ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL) GE Healthcare 17-0407-03 Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside  Fisher Scientific BP1755 Expression
J-25 Centrifuge Beckman Coulter J325-IM-2 Expression
JA-14 Rotor Beckman Coulter 339247 Expression
Lyophilizer Labconco 7755030 ND Formulation
Methanol Fisher Scientific A452-4 ND Formulation
Nitrogen gas Praxair UN1066 ND Formulation
NZCYM media RPI Research Products N7200-1000.0 Expansion & Expression
Pet-22B vector GenScript N/A Transformation
Petri dish Fisher Scientific FB0875718 Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes Fisher Brand 14385 928A Spectral Analysis
Shaking Incubator New Brunswick Scientific M1344-0004 Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys Thermo Scientific 66430 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 68100 Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing Thermo Scientific 88243 Purification
Sodium Chloride Fisher Scientific S271 Purification
Sodium Phosphate dibasic Fisher Scientific S374-500 Purification
Sodium Phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-500 Purification
Spectra/POR Weighted Closures Spectrum Medical Industries 132736 Purification
Spectrophotometer Shimadzu UV-1800 220-92961-01 spectral analysis
Tabletop Centrifuge Beckman Coulter 366816 ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software) Shimadzu N/A Spectral Analysis
Vacuum filter Millipore 9004-70-0 Expression & Purification
Vacuum pump GAST Manufacturing Inc DOA-P704-AA Expression & Purification
Vortex Fisher Scientific 12-812 ND Formulation
Yeast N/A BY4741 Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose BD 242820 Yeast Viability Assay

References

  1. Fox, C. A., Moschetti, A., Ryan, R. O. Reconstituted HDL as a therapeutic delivery device. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (11), 159025 (2021).
  2. Ong, K. L., Cochran, B. J., Manandhar, B., Thomas, S., Rye, K. A. HDL maturation and remodelling. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular and Cell Biology of Lipids. 1867 (4), 159119 (2022).
  3. Nicholls, S. J., et al. Effect of serial infusions of CER-001, a pre-β high-density lipoprotein mimetic, on coronary atherosclerosis in patients following acute coronary syndromes in the CER-001 Atherosclerosis Regression Acute Coronary Syndrome Trial: a randomized clinical trial. JAMA Cardiology. 3 (9), 815-822 (2018).
  4. Kingwell, B. A., Chapman, M. J., Kontush, A., Miller, N. E. HDL-targeted therapies: progress, failures and future. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 445-464 (2014).
  5. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nature Structure & Molecular Biology. 23 (6), 481-486 (2016).
  6. Hoel, C. M., Zhang, L., Brohawn, S. G. Structure of the GOLD-domain seven-transmembrane helix protein family member TMEM87A. eLife. 11, e81704 (2022).
  7. Pérez-Medina, C., et al. PET imaging of tumor-associated macrophages with 89Zr-labeled high-density lipoprotein nanoparticles. Journal of Nuclear Medicine. 56 (8), 1272-1277 (2015).
  8. Fox, C. A., Ryan, R. O. Studies of the cardiolipin interactome. Progress in Lipid Research. 88, 101195 (2022).
  9. Ryan, R. O., Forte, T. M., Oda, M. N. Optimized bacterial expression of human apolipoprotein A-I. Protein Expression and Purification. 27 (1), 98-103 (2003).
  10. Argyri, L., Skamnaki, V., Stratikos, E., Chroni, A. A simple approach for human recombinant apolipoprotein E4 expression and purification. Protein Expression and Purification. 79 (2), 251-257 (2011).
  11. Lethcoe, K., Fox, C. A., Ryan, R. O. Foam fractionation of a recombinant biosurfactant apolipoprotein. Journal of Biotechnology. 343, 25-31 (2022).
  12. Fisher, C. A., et al. Bacterial overexpression, isotope enrichment, and NMR analysis of the N-terminal domain of human apolipoprotein E. Biochemistry and Cell Biology. 75 (1), 45-53 (1997).
  13. Jonas, A. Reconstitution of high-density lipoproteins. Methods in Enzymology. 128, 553-582 (1986).
  14. Ryan, R. O. Nanodisks: hydrophobic drug delivery vehicles. Expert Opinion on Drug Delivery. 5 (3), 343-351 (2008).
  15. Oda, M. N., et al. Reconstituted high density lipoprotein enriched with the polyene antibiotic amphotericin B. Journal of Lipid Research. 47 (2), 260-267 (2006).
  16. Redmond, K. A., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. All-trans-retinoic acid nanodisks. International Journal of Pharmaceutics. 339 (1-2), 246-250 (2007).
  17. Ghosh, M., et al. Curcumin nanodisks: formulation and characterization. Nanomedicine. 7 (2), 162-167 (2011).
  18. Yuan, Y., et al. Synthetic high-density lipoproteins for delivery of 10-hydroxycamptothecin. International Journal of Nanomedicine. 11, 6229-6238 (2016).
  19. Zhao, P., et al. Sphingadienes show therapeutic efficacy in neuroblastoma in vitro and in vivo by targeting the AKT signaling pathway. Investigational New Drugs. 36 (5), 743-754 (2018).
  20. Moschetti, A., et al. Assembly and characterization of biocompatible coenzyme Q10 enriched lipid nanoparticles. Lipids. 55 (2), 141-149 (2020).
  21. Krishnamoorthy, A., Witkowski, A., Ryan, R. O. Nutlin-3a nanodisks induce p53 stabilization and apoptosis in a subset of cultured glioblastoma cells. Journal of Nanomedicine and Nanotechnology. 8 (4), 454 (2017).
  22. Moschetti, A., Fox, C. A., McGowen, S., Ryan, R. O. Lutein nanodisks protect retinal pigment epithelial cells from UV light induced damage. Frontiers in Nanotechnology. 4, 955022 (2022).
  23. Scheetz, L. M., et al. Synthetic HDL nanoparticles delivering docetaxel and CpG for chemoimmunotherapy of colon adenocarcinoma. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1777 (2020).
  24. Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature Communications. 5, 3065 (2014).
  25. Hargreaves, P. L., Nguyen, T. S., Ryan, R. O. Spectroscopic studies of amphotericin B solubilized in nanoscale bilayer membranes. Biochimica et Biophysica Acta. 1758 (1), 38-44 (2006).
  26. Tufteland, M., Pesavento, J. B., Bermingham, R. L., Hoeprich Jr, P. D., Ryan, R. O. Peptide stabilized amphotericin B nanodisks. Peptides. 28 (4), 741-746 (2007).
  27. Tufteland, M., Ren, G., Ryan, R. O. Nanodisks derived from amphotericin B lipid complex. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97 (10), 4425-4432 (2008).
  28. Nguyen, T. S., et al. Amphotericin B induces interdigitation of apolipoprotein stabilized nanodisk bilayers. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (1), 303-312 (2008).
  29. Ryan, R. O. Nanobiotechnology applications of reconstituted high density lipoprotein. Journal of Nanobiotechnology. 8, 28 (2010).
  30. Lalefar, N. R., Witkowski, A., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Wnt3a nanodisks promote ex vivo expansion of hematopoietic stem and progenitor cells. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 66 (2016).
  31. Crosby, N. M., et al. Anti-CD20 single chain variable antibody fragment-apolipoprotein A-I chimera containing nanodisks promote targeted bioactive agent delivery to CD20-positive lymphomas. Biochemistry and Cell Biology. 93 (4), 343-350 (2015).
  32. Ghosh, M., Ren, G., Simonsen, J. B., Ryan, R. O. Cationic lipid nanodisks as an siRNA delivery vehicle. Biochemistry and Cell Biology. 92 (3), 200-205 (2014).
  33. Fox, C. A., Ellison, P., Ikon, N., Ryan, R. O. Calcium-induced transformation of cardiolipin nanodisks. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (5), 1030-1036 (2019).
  34. Fox, C. A., Lethcoe, K., Ryan, R. O. Calcium-induced release of cytochrome c from cardiolipin nanodisks: Implications for apoptosis. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1861 (12), 183722 (2021).
  35. Fox, C. A., Ryan, R. O. Dye binding assay reveals doxorubicin preference for DNA versus cardiolipin. Analytical Biochemistry. 594, 113617 (2020).
  36. Fox, C. A., Romenskaia, I., Dagda, R. K., Ryan, R. O. Cardiolipin nanodisks confer protection against doxorubicin-induced mitochondrial dysfunction. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1864 (10), 183984 (2022).

Play Video

Cite This Article
Lethcoe, K., Fox, C. A., Moh, I., Swackhamer, M., Karo, M., Lockhart, R., Ryan, R. O. Formulation and Characterization of Bioactive Agent Containing Nanodisks. J. Vis. Exp. (193), e65145, doi:10.3791/65145 (2023).

View Video