Formulação e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos

Summary

Aqui, descrevemos a produção e caracterização de agentes bioativos contendo nanodiscos. Os nanodiscos de anfotericina B são tomados como exemplo para descrever o protocolo de forma escalonada.

Abstract

O termo nanodisco refere-se a um tipo discreto de nanopartícula composto por uma bicamada formando lipídio, uma proteína de andaime e um agente bioativo integrado. Os nanodiscos são organizados como uma bicamada lipídica em forma de disco cujo perímetro é circunscrito pela proteína do andaime, geralmente um membro da família das apolipoproteínas trocáveis. Numerosos agentes bioativos hidrofóbicos têm sido eficientemente solubilizados em nanodiscos por sua integração no meio hidrofóbico da bicamada lipídica da partícula, produzindo uma população amplamente homogênea de partículas na faixa de 10-20 nm de diâmetro. A formulação de nanodiscos requer uma proporção precisa de componentes individuais, uma adição sequencial apropriada de cada componente, seguida de sonicação em banho da mistura de formulação. A proteína do arcabouço anfipático entra em contato espontaneamente e reorganiza a bicamada dispersa formando mistura lipídico/agente bioativo para formar uma população discreta e homogênea de partículas de nanodisco. Durante esse processo, a mistura de reação faz a transição de uma aparência opaca e turva para uma amostra clarificada que, quando totalmente otimizada, não produz precipitado após a centrifugação. Estudos de caracterização envolvem a determinação da eficiência de solubilização de agentes bioativos, microscopia eletrônica, cromatografia de filtração em gel, espectroscopia de absorbância no ultravioleta visível (UV/Vis) e/ou espectroscopia de fluorescência. Isto é normalmente seguido por uma investigação da actividade biológica utilizando células cultivadas ou ratinhos. No caso de nanodiscos que abrigam um antibiótico (isto é, o antibiótico polieno macrolídeo anfotericina B), sua capacidade de inibir o crescimento de leveduras ou fungos em função da concentração ou do tempo pode ser medida. A relativa facilidade de formulação, versatilidade em relação às partes componentes, tamanho de partícula em nanoescala, estabilidade inerente e solubilidade aquosa permitem inúmeras aplicações in vitro e in vivo da tecnologia de nanodiscos. No presente artigo, descrevemos uma metodologia geral para formulação e caracterização de nanodiscos contendo anfotericina B como agente bioativo hidrofóbico.

Introduction

As lipoproteínas discoidais nascentes de alta densidade (HDLs) são progenitores naturais da HDL esférica muito mais abundante presente no sistema circulatório humano. Essas partículas nascentes, também chamadas de HDL pré-ß, possuem propriedades estruturais únicas e distintas¹. De fato, em vez de existir como uma partícula esferoidal, as HDLs nascentes são em forma de disco. Extensos estudos de caracterização estrutural das HDLs discoidais naturais e reconstituídas têm revelado que elas são compostas por uma bicamada fosfolipídica cujo perímetro é circunscrito por uma apolipoproteína anfipática trocável (apo), como a apoA-I. No metabolismo das lipoproteínas humanas, as HDLs nascentes circulantes acumulam lipídios das células periféricas e amadurecem em HDLs esféricas em um processo que é dependente de mediadores proteicos chave, incluindo o transportador de de ligação de ATP A1 e lecitina:colesterol aciltransferse². Esse processo representa um componente crítico da via de transporte reverso do colesterol, considerada protetora contra doenças cardíacas. Munidos desse conhecimento e da capacidade de reconstituir HDLs discoidais, pesquisadores têm empregado essas partículas como intervenção terapêutica no tratamento da aterosclerose3. Em essência, a infusão de HDL reconstituído (rHDL) em pacientes promove o efluxo de colesterol dos depósitos de placa e o devolve ao fígado para conversão em ácidos biliares e excreção do corpo. Várias empresas biotecnológicas/farmacêuticas estão adotando essa estratégia de tratamento⁴.

Ao mesmo tempo, a capacidade de gerar essas partículas em laboratório desencadeou uma enxurrada de atividades de pesquisa que levaram a novas aplicações e novas tecnologias. Uma aplicação proeminente envolve o uso de partículas de rHDL como membrana em miniatura para abrigar proteínas transmembrana em um ambiente nativo⁵. Até o momento, centenas de proteínas foram incorporadas com sucesso no rHDL discoidal, e a pesquisa demonstrou que essas proteínas retêm tanto a conformação nativa quanto a atividade biológica como receptores, enzimas, transportadores, etc. Essas partículas, denominadas “nanodiscos”, também têm se mostrado passíveis de caracterização estrutural, muitas vezes em alta resolução⁶. Essa abordagem para investigações de proteínas transmembrana é reconhecida como superior aos estudos com micelas ou lipossomas em detergente e, como resultado, está avançando rapidamente. É importante reconhecer que dois métodos distintos têm sido relatados que são capazes de formar uma rHDL. O método de “diálise por colato”¹³ é popular para aplicações relacionadas à incorporação de proteínas transmembrana na bicamada rHDL⁵. Essencialmente, este método de formulação envolve a mistura de uma bicamada formando fosfolipídio, uma proteína de andaime e a proteína transmembrana de interesse em um tampão contendo o detergente colato de sódio (ou desoxicolato de sódio; peso molecular da micela [PM] de 4.200 Da). O detergente solubiliza eficazmente os diferentes componentes da reação, permitindo que a amostra seja dialisada contra tampão sem detergente. Durante a etapa de diálise, à medida que o detergente é retirado da amostra, forma-se espontaneamente um HDLr. Quando essa abordagem é usada para aprisionar uma proteína transmembrana de interesse, as partículas do produto têm sido denominadas nanodiscos⁵. Tentativas de usar esse método para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de pequenas moléculas (MW <1.000 Da), no entanto, têm sido em grande parte malsucedidas. Ao contrário das proteínas transmembrana, os agentes bioativos de pequenas moléculas são capazes de escapar da bolsa de diálise junto com o detergente, diminuindo consideravelmente sua eficiência de incorporação nas rHDLs. Esse problema foi resolvido com a omissão de detergentes da mistura da formulação¹⁴. Em vez disso, os componentes são adicionados a um tampão aquoso sequencialmente, começando com a bicamada formando lipídio, formando um agente bioativo estável contendo rHDL, referido como um nanodisco. Outros utilizaram a rHDL para incorporação e transporte de imagiologia in vivo ⁷. Mais recentemente, a rHDL especializada composta por um arcabouço apolipoprotéico e o glicerofosfolipídeo aniônico, cardiolipina, tem sido empregada em estudos de ligação de ligantes. Essas partículas fornecem uma plataforma para estudos da interação da cardiolipina com vários ligantes solúveis em água, incluindo cálcio, citocromo c e o agente anticâncer doxorrubicina⁸.

O foco do presente estudo está na formulação de rHDL que possuam um agente bioativo hidrofóbico incorporado de forma estável (i.e. nanodisco). A capacidade desses agentes de se integrarem ao meio lipídico das partículas de rHDL discoidal lhes confere solubilidade aquosa. Como tal, os nanodiscos têm potencial para aplicações terapêuticas in vivo . Ao formular nanodiscos, condições específicas de incubação/reação são necessárias para incorporar com sucesso agentes bioativos hidrofóbicos discretos na partícula do produto, e o objetivo deste relatório é fornecer informações práticas detalhadas que podem ser usadas como um modelo fundamental para a criação de novas partículas de nanodiscos para aplicações específicas. Assim, no contexto deste manuscrito os termos nanodisco e nanodisco não são intercambiáveis. Enquanto nanodisco refere-se a um rHDL formulado para conter uma proteína transmembrana embutida em sua bicamada lipídica⁵, o termo nanodisco refere-se a um rHDL formulado para incorporar agentes bioativos hidrofóbicos de baixo peso molecular (< 1.000 Da), como a anfotericina B¹⁴.

Uma variedade de métodos está disponível para a aquisição de proteínas adequadas do arcabouço. É possível comprar proteínas de andaimes de fabricantes [por exemplo, apoA-I (SRP4693) ou apoE4 (A3234)], no entanto, o custo pode ser um fator limitante. Uma abordagem preferida é expressar proteínas recombinantes do arcabouço em Escherichia coli. São publicados protocolos para apoA-I⁹, apoE4¹⁰ e apolipoforina-III humana e para a proteína de hemolinfa de insetos apolipoforina-III11. Para os experimentos aqui descritos, foi utilizado o domínio N-terminal (NT) humano recombinante da apoE4 (aminoácidos 1-183). A sequência de nucleotídeos que codifica apoE4-NT humana foi sintetizada e inserida em um vetor de expressão pET-22b (+) diretamente adjacente à sequência líder pelB codificada vetorialmente. Este construto leva à expressão de uma proteína de fusão da sequência líder da pelB-apoE4-NT. Após a síntese proteica, a sequência líder da pelB bacteriana direciona a proteína recém-sintetizada para o espaço periplasmático, onde a peptidase líder cliva a sequência da pelB. A proteína apoE4-NT resultante, sem tags de sequência ou caudas, posteriormente escapa da bactéria e se acumula no meio de cultura^11,12, simplificando o processamento a jusante.

Protocol

1. Transformação, expressão e purificação do componente proteico do andaime Transformação bacteriana BL21 com apoE4-NT contendo plasmídeoDescongelar um tubo de células competentes BL21 (DE3) no gelo por 10 min. Depois que todo o gelo derreter, misture suave e cuidadosamente pipetar 50 μL das células em um tubo de transformação sobre gelo. Adicionar 5 μL contendo 50 ng de ADN plasmidial (para sequência, ver quadro suplementar 1) à mi…

Representative Results

Processo de formulação de nanodiscos de agentes bioativosNo procedimento de formulação de ampB-nanodisco descrito, a reação é considerada completa quando a aparência da amostra transita de turva para clara (Figura 1). Essa alteração indica que nanodiscos se formaram e que o agente bioativo foi solubilizado. Muitas vezes, os agentes bioativos absorvem luz na região do comprimento de onda visível (por exemplo, ampB, curcumina, luteína, coenzima Q10)…

Discussion

A formulação de um agente bioativo contendo nanodiscos fornece um método conveniente para solubilizar compostos hidrofóbicos insolúveis. Como os nanodiscos do agente bioativo do produto são totalmente solúveis em meio aquoso, eles fornecem um método de liberação útil para uma ampla gama de moléculas hidrofóbicas (Tabela 1). Estes incluem pequenas moléculas, drogas naturais e sintéticas, fitonutrientes, hormônios, etc. A estratégia de formulação geralmente segue um protocolo padrão que…

Materials

Amphotericin B	Cayman Chemical Company	11636	ND Formulation & Standard Preparation
Ampicillin	Fisher Scientific	BP17925	Transformation & Expansion
ApoE4-NT Plasmid	GenScript	N/A	Transformation
Baffled Flask	New Brunswick Scientific	N/A	Expansion & Expression
BL21 competent E coli	New England Biolabs	C2527I	Transformation
Centrifuge bottles	Nalgene	3140-0250	Expression
Chloroform	Fisher Scientific	G607-4	ND Formulation
DMSO	Sigma Aldrich	472301	Standard Prepartation
Dymyristoylphosphatidylcholine	Avanti Lipids	850345P	ND Formulation
Erlenmeyer flask	Bellco Biotechnology	N/A	Expansion & Expression
Falcon Tubes	Sarstedt Ag & Co	D51588	Yeast Viability Assay
Glass borosilicate tubes	VWR	47729-570	ND Formulation
GraphPad (Software)	Dotmatics	N/A	Yeast Viability Assay
Heated Sonication Bath	VWR	N/A	ND Formulaton
Heating and Nitrogen module	Thermo Scientific	TS-18822	ND Formulation
HiTrap Heparin HP (5 mL)	GE Healthcare	17-0407-03	Purification
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside	Fisher Scientific	BP1755	Expression
J-25 Centrifuge	Beckman Coulter	J325-IM-2	Expression
JA-14 Rotor	Beckman Coulter	339247	Expression
Lyophilizer	Labconco	7755030	ND Formulation
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	ND Formulation
Nitrogen gas	Praxair	UN1066	ND Formulation
NZCYM media	RPI Research Products	N7200-1000.0	Expansion & Expression
Pet-22B vector	GenScript	N/A	Transformation
Petri dish	Fisher Scientific	FB0875718	Transformation & Expansion
Quartz Cuvettes	Fisher Brand	14385 928A	Spectral Analysis
Shaking Incubator	New Brunswick Scientific	M1344-0004	Transformation, Expansion, & Expression
Slide-A-Lyzer Buoys	Thermo Scientific	66430	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	68100	Purification
SnakeSkin Dialysis Tubing	Thermo Scientific	88243	Purification
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271	Purification
Sodium Phosphate dibasic	Fisher Scientific	S374-500	Purification
Sodium Phosphate monobasic	Fisher Scientific	BP329-500	Purification
Spectra/POR Weighted Closures	Spectrum Medical Industries	132736	Purification
Spectrophotometer	Shimadzu UV-1800	220-92961-01	spectral analysis
Tabletop Centrifuge	Beckman Coulter	366816	ND Formulation
UVProbe 2.61 (Software)	Shimadzu	N/A	Spectral Analysis
Vacuum filter	Millipore	9004-70-0	Expression & Purification
Vacuum pump	GAST Manufacturing Inc	DOA-P704-AA	Expression & Purification
Vortex	Fisher Scientific	12-812	ND Formulation
Yeast	N/A	BY4741	Yeast Viability Assay
Yeast Extract-Peptone-Dextrose	BD	242820	Yeast Viability Assay